bFGF通过β-catenin信号通路促进大鼠外周血间充质干细胞增殖

摘要

碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)可促进骨髓及脐带血间充质干细胞增殖。然而,bFGF对大鼠外周血间充质干细胞(peripheral blood mesenchymal stem cells,PBMSCs)是否具有促增殖作用,尚缺乏系统研究。本研究旨在探讨bFGF在大鼠PBMSCs体外培养和扩增中的作用及机制。从大鼠腹主动脉收集动脉血,用Ficoll分离液分离出单个核细胞(mononuclear cells, MNCs),将MNCs用不含bFGF(对照组)和含bFGF(10,20 ng/mL)的DMEM培养基进行贴壁培养获得PBMSCs。取第3代PBMSCs通过流式细胞法分析其细胞表面标志表达情况,以及bFGF对PBMSCs细胞周期的影响。并评价bFGF对其细胞克隆形成数量、细胞增殖和对细胞周期蛋白D1(cyclin D1),细胞周期蛋白E(cyclin E),p21和β-联蛋白(β-catenin)表达的影响。三组之间PBMSCs细胞形态无差异。PBMSCs培养至14 d可出现细胞克隆,细胞培养至21 d,相比于对照组,10 ng/mL bFGF组和20 ng/mL bFGF组PBMSCs细胞汇合度分别增加40%(P<0.05)和80%(P<0.05);20 ng/mL组PBMSCs细胞汇合度较10 ng/mL组增加28%(P<0.05)。第3代PBMSCs高表达MSC标记蛋白CD29和CD90,低表达CD45,符合MSC的细胞表型特征。与对照组比较,10 ng/mL和20 ng/mL bFGF组PBMSCs细胞克隆数分别增加51%(P<0.05)和92%(P<0.05);20 ng/mL组PBMSCs细胞克隆数较10 ng/mL组进一步增加14%(P<0.05)。PBMSCs生长曲线表明,PBMSCs在培养7 d时,与对照组比较,10 ng/mL和20 ng/mLbFGF组PBMSCs细胞数分别增加41%(P<0.05)和61%(P<0.05),且20 ng/mL组间的PBMSCs细胞数明显高于10 ng/mL bFGF组(P<0.05)。流式检测细胞周期结果表明,相比于对照组,10 ng/mL和20 ng/mL bFGF组处于G1期的PBMSCs细胞数显著降低(P<0.05),处于S期的PBMSCs细胞数显著增加(P<0.05)。与10 ng/mL组相比,20 ng/mL bFGF组处于G1期的PBMSCs细胞数显著降低(P<0.05),处于S期的PBMSCs细胞数显著增加(P<0.05)。免疫荧光结果表明,与对照组相比,10 ng/mL和20 ng/mL bFGF显著促进PBMSCsβ-联蛋白核转位和核表达。与10 ng/mL组相比,20 ng/mL bFGF组PBMSC s表现出更强的β-联蛋白核转位和核表达。蛋白质印迹结果表明,与对照组比较,10 ng/mL bFG和20 ng/mLbFGF组β-联蛋白及其靶蛋白细胞周期蛋白D1和细胞周期蛋白E表达量均显著上调(均P<0.05),而p21蛋白表达量显著下调(P<0.05)。与10 ng/mL组相比,20 ng/mL bFGF组细胞周期蛋白D1,细胞周期蛋白E和β-联蛋白表达量均显著上调,p21蛋白表达量显著下调(均P<0.05)。本研究结果证实,bFGF通过激活细胞周期蛋白和β-联蛋白表达,进而促进PBMSCs增殖,将有助于体外大量获得PBMSCs并用于干细胞工程。