人胃黏膜细胞cDNA文库和pGBKT7p-37重组质粒的构建(英文)

摘要

目的　构建人胃黏膜细胞cDNA文库 ,并选取VacA毒素的p37片段将其克隆到 pGBKT7以表达BD p37融合蛋白作为诱饵。为进一步用所此诱饵来筛选所构建文库以其找到与VacA相互作用的蛋白奠定基础。方法　用TRIzol试剂从胃腺癌病人手术切除的正常胃黏膜细胞中抽取总RNA经LD PCR得到双链cDNA ,参照Clontech的MATCHMAKERLibraryConstructionandScreeningKit构建cDNA文库并用文库所含的独立克隆数和含插入片段的克隆数占总克隆数的比例来评价酵母双杂交文库的质量。用PCR从Helicobacterpylor基因组中扩增出p 37基因将其克隆入 pGBKT7载体并使插入片段与GAL4BD同框 ,插入片段的大小和序列的正确性由双酶切和测序得以证实。结果　文库中共有 1.9× 10 6个独立克隆 ,含插入片段克隆所占比例为 91.7%。双酶切和测序结果表明 p37的正确插入 ,Westernblot结果证明了融合蛋白的表达。 结论　构建了较高质量的cDNA文库和与GAL4BD融合的诱饵蛋白 ,为进一步的研究奠定了基础。