肿瘤标志物中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白(NGAL)与钙调磷酸酶B同源蛋白2(CHP2)的生物学功能研究

摘要

背景:乳腺癌是威胁女性生存的主要肿瘤之一。NGAL为lipocalin蛋白家族的新成员,具有典型的β折叠桶状保守结构,是一种25kD的分泌型糖蛋白。因其结合配体的多样性,NGL在诸如细胞生长、分化、肿瘤迁移与侵袭以及EMT转变等众多生理与病理学过程中扮演着重要的角色。大量研究结果表明NGAL是一种新的肿瘤标志物,为潜在的肿瘤治疗靶点。NGAL的生物学功能及其表达调控模式因肿瘤种类及其分型而有所不同。研究表明在乳腺癌中NGAL的表达亦与乳腺癌种类及亚型有关,其表达受雌激素受体ER以及转录因子NFAT的调控。在机体内部基因表达调控是一个十分复杂的过程,NGAL在肿瘤细胞内表达的异质性正显示了基因表达调控的复杂性。C/EBPζ为C/EBP家族转录因子成员,对C/EBP家族其他成员的转录调控活性起着负调控的作用。已有研究表明在白血病等肿瘤中C/EBPζ表达明显降低。结合文献以及生物信息学分析我们在NGAL的启动子区发现了潜在的C/EBPζ作用位点,但C/EBPζ是否参与NGAL的表达调控尚不明确。钠氢交换体1(NHE1,Na+/H+exchanger1)对细胞的pHi起着重要的调节作用,肿瘤细胞内的碱化作用是肿瘤进程中的标志性事件之一。NHE1介导的肿瘤细胞内pHi升高是否对乳腺癌细胞内C/EBPζ以及NGAL的表达具有调控作用仍不明了。
　　 目的:以ER受体阴性、具高侵袭能力的乳腺癌MDA-MB-231细胞株为研究对象,分析转录因子C/EBPζ以及NGAL基因在其转移中的生物学作用及其机制。在此基础上阐明NHE1以及C/EBPζ对NGAL基因的调控机制。
　　 方法:采用实时定量PCR、western blotting技术检测NGAL在迁移能力不同的细胞系中的差异性表达；通过过表达转录因子C/EBPζ以及基因沉默技术干扰NGAL基因分别研究C/EBPζ以及NGAL在乳腺癌转移中的生物学作用。酶谱法检测过表达C/EBPζ以及干扰NGAL后MMPs蛋白活性的改变。构建NGAL启动子的荧光素酶报告质粒,采用双荧光素酶报告系统研究C/EBPζ以及NHE1对NGAL转录的调控。采用WNT以及NF-κB通路的抑制剂分析了相关信号通路在NGAL介导的肿瘤细胞转移中的生物学作用。
　　 结果:相比低迁移能力的ER+的乳腺癌细胞系MCF7,MDA—MB-231细胞系中NGAL基因的表达显著升高,显示了NGAL对转移能力的潜在调控。过表达C/EBPζ以及干扰NGAL基因后MDA-MB-231细胞的转移能力明显受到抑制,细胞的MMPs家族蛋白的表达及其活性均受到影响。双荧光素酶报告实验证实C/EBPζ对NGAL基因启动子的活性有明显的调节作用。采用NHE1的选择性抑制剂Cariporide抑制其活性后,MDA-MB-231细胞的侵袭能力受到明显抑制。双荧光素酶报告实验证实这种抑制作用部分源于C/EBPζ升高所引起NGAL表达降低来完成的。
　　 结论:C/EBPζ通过调节NGAL启动子的转录活性来抑制NGAL的表达,进而实现其对MDA—MB-231细胞转移能力的调控。NHE1以及基质金属蛋白酶家族MMPs参与了这一过程的调控。NGAL及其上游相关调控通路是ER-乳腺癌的潜在治疗靶点。