滇重楼GAox基因克隆及其在种子萌发过程中表达规律研究

摘要

滇重楼(Paris polyphylla Sm.var.yunnanensis(Fr.)Hand)为百合科(Liliaceae)重楼属(Paris L.)植物，为稀缺名贵中药材。近年来，随着野生资源的枯竭，滇重楼的人工栽培的面积在逐步扩大，但其种子休眠和幼苗生长缓慢的特性制约了栽培生产。目前人们对滇重楼种子休眠的研究多为物理化学等方法，如温度、层积、外源赤霉素处理等，对种子休眠的分子机理研究并不多，其分子机制还不清楚。研究表明，植物赤霉素(GA)在种子萌发发育中起着重要作用，GA2-氧化酶、GA20-氧化酶、GA3-氧化酶是赤霉素合成与代谢过程中的关键酶，它们均由多基因家族编码，参与着赤霉素水平的调控。迄今为止对滇重楼的GA氧化酶相关基因在其种子发育及萌发过程的研究还没有相关报导。本研究将从前期高通量测序获得滇重楼转录组数据入手，挖掘可能参与种子发育和休眠解除的GAox基因，克隆鉴定GAox基因家族的成员，运用生物信息学分析方法对GAox基因进行了序列比对，系统发育分析，蛋白物理特征、保守功能域和三维结构的预测。运用qRT-PCR技术分析GAox基因在滇重楼种子萌发过程中及在不同器官中表达量的变化。本研究根据筛选得到的23条GA氧化酶相关序列设计了特异性PCR引物，成功地克隆了滇重楼的6条GAox基因的全长编码框区，大小在1000bp左右，分别命名为PpGA2ox1、PpGA2ox2、PpGA2ox3、PpGA2ox4、PpGA20ox1和PpGA3ox1，并提交到GenBank数据库，同时分析了这些基因家族成员的系统进化史和蛋白的基本属性。运用荧光定量PCR对GAox基因在不同发育阶段的种子和不同器官内的表达量进行了分析，分析结果表明，PpGA2ox1与PpGA2ox3随着种子的萌发，基因表达量明显下调，可能与种子的休眠有关。PpGA2ox2、PpGA2ox4和PpGA3ox1随着种子的萌发基因表达量明显上调，可能与种子的休眠解除有关。PpGA20ox1的表达量虽有小幅波动但总体表达量一直维持在较低的水平，在种子萌发发育过程中，该基因的作用还不确定。本研究发现PpGA2ox1、PpGA2ox2、PpGA2ox3、PpGA2ox4、和PpGA3ox1基因表达量变化主要发生在6～9周，该时间区间是滇重楼种子从休眠状态转为破除休眠状态的一个关键期。GAox基因在不同器官中的表达具有很明显的差异，PpGA2ox1、PpGA2ox2和PpGA2ox3在种子中特异性表达，PpGA2ox4和PpGA3ox1在根中特异性表达，PpGA20ox1在花中特异性表达。这些基因在滇重楼的不同组织部位存在着不同的表达模式，可能在不同的组织生长发育过程中发挥着不同的作用。以上研究为后期更进一步探索GAox基因的功能及其在滇重楼种子萌发过程的作用，阐明滇重楼种子休眠的分子机理有着重要的理论意义。

目录

声明

摘要

英文略缩词

前言

第一章 文献综述

1．1 赤霉素在植物生长中的作用

1．1．1 赤霉素简介

1．1．2 赤霉素的生物合成与代谢

1．1．3 赤霉素生物合成与代谢过程中的关键酶

1．1．5 GA-3氧化酶(GA-3oxidase，GA3ox)

1．1．6 GA-2氧化酶(GA-2 oxidase，GA2ox)

1．2 GAox基因在药用植物中的研究进展

1．3 滇重楼的有性繁殖研究

1．4 本研究的意义

第二章 GAox基因的克隆、鉴定及生物信息学分析

2．1 材料、试剂和仪器

2．2 方法

2．2．1 转录组数据挖掘

2．2．2 种子处理

2．2．3 植物总RNA的提取及cDNA的合成

2．2．4 反转录合成cDNA的体系及程序

2．2．5 GAox基因的扩增、克隆及测序

2．2．6 序列分析

2．2．7 滇重楼GAox基因系统发育分析

2．2．8 滇重楼GAox蛋白的物理特性预测

2．2．9 滇重楼GAox基因蛋白质的结构域和同源建模分析

2．3 结果

2．3．1 转录组数据挖掘

2．3．2 总RNA提取及检测结果

2．3．3 cDNA第一链的合成结果

2．3．4 GAox基因的扩增、克隆及测序

2．3．5 序列分析

2．3．6 滇重楼GAox基因系统发育分析

2．3．7 滇重楼GAox蛋白的物理特性预测

2．3．8 滇重楼GAox蛋白结构域分析

2．3．9 滇重楼PpGA2ox1及PpGA2ox1蛋白三维结构建模

2．4 讨论

第三章 GAox基因在种子萌发过程中的表达分析

3．1 材料、试剂和仪器

3．2 方法

3．2．1 实验材料处理

3．2．2 植物总RNA的提取

3．2．3 反转录合成cDNA的体系及程序

3．2．4 引物设计

3．2．5 内参基因的筛选

3．2．6 半定量PCR

3．2．7 荧光定量PCR

3．3 结果

3．3．1 种子及胚形态观察及萌发阶段划分

3．3．2 总RNA质量检测以及cDNA第一链合成

3．3．3 cDNA第一链的合成结果

3．3．4 内参基因的筛选

3．3．5 半定量PCR

3．3．6 荧光定量PCR

3．4 讨论

第四章 主要结论

参考文献

附录

作者简介

致谢