C/EBPβ亚型LAP1抑制肝癌细胞上皮-间充质转变及其特性的研究

摘要

目的:　　上皮-间充质转化(Epithelial-mesenchymal transformation，EMT)是指在特定环境下上皮组织细胞失去其极性向间充质细胞及相应表型转化的过程，其表现特征为细胞与细胞间粘附性降低或消失，极性丧失，细胞运动活性及转移侵袭能力提高。发生EMT后细胞由多边形转变为梭形，同时上皮细胞的特异分子标记物表达量减弱，而间充质细胞的特异分子标志物则获得了明显增强。Snail和Slug被认为是Snail家族中调节肿瘤细胞发生EMT的主要核转录因子，直接参与诱导间充质标志物的生成，比如Vimentin和N-cadherin，同时还能够抑制上皮细胞标志物E-cadherin的生成。TGF-β/Smads通路被认为是调节Snail生成的经典信号通路。TGF-β在进展期癌细胞中起到增进作用，同时也是被证明是癌细胞发生EMT的起因。随着对EMT研究的逐渐深入，近些年在多种肿瘤细胞中，包括乳腺癌、肺癌及神经胶质瘤中，EMT均起重要作用。此外，在肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)的病理进程中也会发现EMT现象，而且与癌细胞的转移和侵袭有密切关系。EMT相关分子机制的阐明，对于改善肝癌患者的预后，以及探索新的靶向治疗方案具有重大意义。　　CCAAT/增强子结合蛋白(C/EBPs)是一类参与调节多种组织功能的亮氨酸拉链转录因子。该家族成员C/EBPβ基因转录的mRNA可翻译出三种不同蛋白亚型，其38kDa肝脏高表达激活型蛋白(liver-enriched activator proteins1，LAP1)是主要表达于肝脏的转录因子，在肝细胞的炎症反应、肿瘤发生、分化、增殖和存活中都起关键作用。有文章指出LAP1在癌细胞所在区域中的表达量明显低于相应癌周组织。在本实验室前期工作中发现，LAP1可以有效抑制肝癌细胞的干细胞特性，包括癌细胞的生长速度及增殖能力，同时也发现提高LAP1的表达能够促进肝癌细胞向上皮样表型转变，并抑制转移和侵袭能力，说明LAP1很可能与肝癌细胞的EMT有关。　　本课题利用人肝癌细胞系Hep3B和SMMC-7721，通过细胞生物学及分子生物学等手段，探究C/EBPβ的亚型LAP1能否抑制肝癌细胞EMT表型及可能的分子机制，为今后肝癌患者的预后判断及靶向诊疗提供了新的方法和思路。　　方法:　　1、采用免疫组化和RT-Time PCR实验，测定肝癌患者癌及相应癌旁组织样品中C/EBPβ的表达状况。同时结合患者病例资料分析高转移肝癌患者肿瘤组织样品对比低转移组C/EBPβ的表达状况与明确C/EBPβ与肝癌转移之间存在关联性。　　2、建立过表达LAP1的Hep3B和SMMC-7721细胞，根据蛋白免疫印迹实验、RT-PCR检测LAP1是否成功过表达。光学显微镜下观察过表达LAP1后Hep3B和SMMC-7721细胞上皮样表型变化情况。通过Western Blotting、RT-Time PCR和细胞免疫荧光实验迸一步确定过表达LAP1是否促进上皮标志物E-cadherin表达，同时抑制间充质样标志物N-cadherin和Vimentin表达。　　3、建立敲低C/EBPβ的Hep3B和SMMC-7721细胞，利用蛋白免疫印迹实验、RT-PCR检测C/EBPβ敲低情况。观察Hep3B和SMMC-7721细胞敲低后间充质样表型变化情况。通过Western Blotting、RT-Time PCR和细胞免疫荧光实验进一步确定敲低C/EBPβ是否抑制上皮标志物E-cadherin表达，并促进间充质样标志物N-cadherin和Vimentin表达。　　4、运用Transwell及含基质胶Transwell方法，检测过表达LAP1及敲低C/EBPβ的Hep3B和SMMC-7721细胞对比对照组，其转移和侵袭能力的变化。　　5、通过Western Blotting和RT-Time PCR实验，检测C/EBPβ对EMT相关转录因子Snail和Slug表达量的影响。通过Western Blotting实验，检测调节Snail和Slug表达的TGF-β/Smads信号通路中主要因子Smad3的表达量及磷酸化程度。　　6、通过6周龄雄性裸鼠尾静脉注射法建立肝癌肺转移模型，分别对比过表达LAP1及敲低C/EBPβ后SMMC-7721细胞相对于对照组在裸鼠肺内的肝癌细胞转移情况。　　结果:　　1、采用免疫组化和RT-Time PCR实验，测定肝癌患者癌及相应癌旁组织样品中C/EBPβ的表达状况。同时结合患者病例资料分析高转移肝癌患者肿瘤组织样品对比低转移组C/EBPβ的表达状况与明确C/EBPβ与肝癌转移之间存在关联性。　　2、建立过表达LAP1的Hep3B和SMMC-7721细胞，根据蛋白免疫印迹实验、RT-PCR检测LAP1成功过表达。光学显微镜下观察过表达LAP1后Hep3B和SMMC-7721细胞上皮样表型明显增多，并计数后统计分析。通过Western Blotting、RT-Time PCR和细胞免疫荧光实验进一步确定过表达LAP1促进上皮标志物E-cadherin表达，同时抑制间充质样标志物N-cadherin和Vimentin表达，证实过表达LAP1能够抑制肝癌细胞的EMT。　　3、建立敲低C/EBPβ的Hep3B和SMMC-7721细胞，利用蛋白免疫印迹实验、RT-PCR检测C/EBPβ被成功敲低。观察Hep3B和SMMC-7721细胞敲低后间充质样表型明显增多，并计数分析。通过Western Blotting、RT-Time PCR和细胞免疫荧光实验进一步确定敲低C/EBPβ抑制上皮标志物E-cadherin表达，同时促进间充质样标志物N-cadherin和Vimentin表达，证实敲低C/EBPβ能够促进肝癌细胞的EMT。　　4、干扰C/EBPβ的表达显著改变了EMT标记物的mRNA和蛋白的表达量，过表达LAP1能促进上皮标记物E-cadherin的表达，同时间充质标记物N-cadherin和Vimentin的表达被抑制。而敲低C/EBPβ则结果相反。　　5、在肝癌细胞中过表达LAP1可抑制TGF-β/Smads通路中Smad3的表达及磷酸化过程，进而抑制该通路下游靶基因Snail和Slug的表达。而敲低C/EBPβ则获得相反结果。　　6、通过裸鼠肝癌肺转移模型的对比研究发现过表达LAP1的肝癌细胞在裸鼠体内转移率明显低于对照组，而敲低C/EBPβ后其癌细胞转移效率明显提高。　　结论:　　C/EBPβ亚型LAP1表达量的降低能够促进肝癌细胞的EMT过程，进而导致肿瘤细胞的转移和侵入能力加强。这是由于LAP1能够抑制TGF-β/Smads细胞信号通路中关键转录因子Smad3的表达及其磷酸化过程，进而抑制下游的核转录因子Snail和Slug的表达，而LAP1的下调导致TGF-β/Snail轴的异常活跃致使肝癌细胞的EMT增强。

目录

声明

摘要

英文缩略词表

前言

材料与方法

一、主要器材和设备

二、主要试剂及配方

三、细胞生物学相关细胞及组织样品

四、实验方法

实验结果

二、过表达C／EBPβ亚型LAP1抑制肝癌细胞的EMT

三、敲低C／EBPβ促进肝癌细胞的EMT

四、LAP1抑制肝癌细胞侵袭和迁移

五、C／EBPβ抑制肝细胞癌TGF-β／Smads通路

六、C／EBPβ抑制肝细胞癌的肺转移

讨论

结论

参考文献

综述

在读期间发表的论文

致谢