天然产物小檗胺靶分了钙离子/钙调素依赖的蛋白激酶Ⅱγ在慢性髓系白血病细胞增殖调控中的作用及机制研究

摘要

慢性髓性白血病(chronic myeloid leukemia,简称CML)是一种常见的严重危害人类健康的血液系统恶性肿瘤，在我国CML占总白血病的20％左右。特征性Ph染色体是CML的标记性改变。它是由于9号和22号染色体发生断裂，平行交互易位形成Ph染色体，产生BCR-ABL融合基因，编码p210或p190的BCR-ABL融合蛋白，使酪氨酸激酶活性异常增强，激活多条信号传导途径，导致细胞增殖周期失控、凋亡受阻，最终导致CML的发生。而相应的，针对BCR-ABL融合蛋白的靶向药物酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)，如伊马替尼(Imatinib，IM)，已成为Ph+CML患者的一线治疗药物，接受伊马替尼治疗的CML患者五年总生存率可达89.4％(86％-92％)。然而，令人遗憾的是，伊马替尼类分子靶向药物不能完全清除患者体内BCR-ABL阳性白血病细胞克隆，并不能使多数CML患者获得长期缓解，停药后很快复发，其中一些患者对伊马替尼类分子靶向药物产生耐药。并且，越来越多的临床和实验研究资料显示，单用分子靶向药物只能控制慢性期CML，而对加速期和急变期CML基本无效，更不能治愈CML。近年来研究发现，白血病干细胞(leukemia stem cell，LSC)对于CML耐受分子靶向药物和化疗药物有着举足轻重的作用，并且也是白血病起始和复发中的关键因素。CML患者要获得长期缓解和治愈，必需清除这些恶性肿瘤干细胞。因此，筛选和鉴定白血病干细胞治疗性药物靶标，并阐述其作用分子机制显得十分迫切。
　　小檗胺(Berbamine，BBM)是从我国中草药小檗属植物中提取的一种双苄基异喹啉类生物碱药物。我们前期研究显示不论在体外或体内小檗胺均能有效抑制伊马替尼耐药CML细胞的增殖，但对正常造血细胞增殖没有明显抑制作用。这表明小檗胺很可能对CML干细胞具有特异性杀伤作用，这将对CML的根治具有重要的临床意义。因此本研究重点是对小檗胺抗白血病作用的靶分子的作用及其分子机制进行初步探讨。
　　研究目的：
　　1研究天然小分子化合物小檗胺对白血病干细胞或T315I突变耐药CML细胞的清除作用。
　　2筛选并鉴定小檗胺在抗CML作用中的特异性靶标，并研究小檗胺对该蛋白靶标的抑制作用。
　　3探讨该蛋白靶标调控CML干细胞存活、自我更新和凋亡抵抗的分子机制，从而明确小檗胺对CML干细胞清除作用的内在分子机制。
　　研究方法：
　　1用体外MTT实验，研究天然小分子化合物小檗胺对伊马替尼耐药的K562细胞或BCR-ABL T315I耐药突变的KCL-22M的清除作用。
　　2用体内异种移植瘤模型，研究小檗胺对伊马替尼耐药的K562细胞或原代CML细胞NOD/SCID鼠移植瘤的抑制作用。
　　3细胞活力和凋亡自噬相关蛋白检测，研究小檗胺诱导CML细胞死亡的方式。
　　4联合应用小檗胺亲和基质，蛋白质质谱、免疫印迹和计算机模拟等技术和方法，筛选并鉴定小檗胺在抗CML作用中的特异性靶标。
　　5用免疫印迹技术，研究小檗胺对该蛋白靶标的抑制作用。
　　6用免疫印迹、免疫共沉淀等技术，研究小檗胺对CML干细胞清除作用的内在分子机制。
　　研究结果：
　　1体外MTT证实小檗胺可清除对伊马替尼耐药的K562细胞或BCR-ABL T315I耐药突变的KCL-22M细胞。
　　2体内异种移植瘤证实小檗胺可明显抑制伊马替尼耐药的K562细胞或原代CML细胞裸鼠移植瘤的生长。
　　3细胞活力和凋亡自噬相关蛋白检测证实小檗胺可诱导CML细胞凋亡、自噬等死亡途径的发生。
　　4小檗胺亲和基质，蛋白质质谱、免疫印迹和计算机模拟等技术证实小檗胺能结合并抑制CML细胞中钙离子/钙调素依赖的蛋白激酶Ⅱγ(CaMKⅡγ)激酶;并能特异性结合CaMKⅡγ激酶的ATP结合袋结构域。
　　5免疫印迹技术证实CaMKⅡγ激酶是小檗胺抗慢性髓系白血病作用的关键靶分子。
　　6免疫共沉淀、免疫印迹等技术证实小檗胺可抑制CaMKⅡγ激酶依赖的NF-κB、β-catenin和Stat3等信号通路来清除CML干细胞。
　　结论：
　　1小檗胺可有效清除LSCs和BCR-ABL的T315I突变细胞。
　　2小檗胺能结合并抑制CML细胞中CaMKⅡγ激酶;小檗胺能特异性结合CaMKⅡγ激酶的ATP结合袋结构域。
　　3 CaMKⅡγ激酶是小檗胺抗慢性髓系白血病作用的关键靶分子;
　　4小檗胺抗白血病活性主要通过抑制CaMKⅡγ激酶依赖的NF-κB、β-catenin和Stat3等信号通路。