GM1联合生长因子诱导人骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的研究

摘要

目的:骨髓间充质干细胞(BMSCs)是一群能不断自我更新、分裂增殖，且具多谱系分化潜能的多能干细胞。碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和表皮生长因子(EGF)能有效促进 BMSCs向神经元样细胞分化，且对细胞几乎无毒副作用。单唾液酸四己糖神经节苷脂(GM1)是神经细胞质膜的重要组成成分，对神经细胞分化和成熟过程必不可少，并可保护和修复受损神经细胞。本研究旨在探讨GM1联合生长因子(bFGF+EGF)能否更为高效地促进 BMSCs分化为神经元样细胞，从而为细胞替代治疗神经系统变性疾病提供实验依据。
　　方法:采用密度梯度离心法获取骨髓单个核细胞，行原代、传代培养，观察细胞形态变化和生长情况；取第3代 BMSCs，用流式细胞术鉴定其表面标志物(CD29、CD105、CD34、CD45)；同时鉴定其多分化潜能。将第3代 BMSCs分四组向神经元样细胞诱导分化，A组：单用生长因子(bFGF+EGF)；B组：单用 GM1；C组：GM1联合生长因子(bFGF+EGF)；D组：对照组。分别在正式诱导前、后行免疫细胞化学法检测各组细胞 Nestin、β-TubulinⅢ、GFAP的阳性表达率并用 SPSS18.0进行数据统计分析。
　　结果:骨髓单个核细胞接种于培养瓶24h后可见多数细胞已贴壁，48h首次全量换液，可见较多骨髓单个核细胞散在分布。原代培养5-6天可见散在分布的短梭形、多角形或宽大扁平形细胞而形成的集落；8-11天，细胞生长速度明显加快，形态逐渐变成梭形；14-16天，细胞逐渐铺满培养瓶底，可达80％-90%融合，呈漩涡状分布；传代后的细胞，形态与原代相似，但其生长潜伏期明显缩短。流式细胞术鉴定第3代 BMSCs表面标志物呈 CD29(+)、CD105(+)、CD34(-)、CD45(-)；同时其具分化为成骨细胞和成脂细胞潜能。BMSCs诱导分化为神经元样细胞之前，四组细胞 Nestin、β-Tubulin、GFAP表达均呈阴性；正式诱导2-4天，A、B、C三组 Nestin阳性细胞表达率均呈上升趋势，且 C组高于A、B、D组；正式诱导6-8天，A、B、C三组 Nestin阳性细胞表达率均有所降低，而β-TubulinⅢ、GFAP阳性细胞表达率则呈较明显上升趋势，且 C组较 A、B组升高明显。综合实验数据，C组的Nestin、β-TubulinⅢ、GFAP阳性细胞表达率均高于A、B、D组。
　　结论:1.采用密度梯度离心法结合细胞贴壁培养法来分离、培养 BMSCs，可获得较高纯度的BMSCs，且细胞活性较高，适用于进一步实验研究。2. GM1联合生长因子(bFGF+EGF)相比单独的生长因子(bFGF+EGF)或 GM1，可更为高效地促进 BMSCs诱导分化为神经元样细胞。

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引言

1 BMSCs的分离、原代及传代培养、冻存和鉴定

1.1实验材料

1.1.1 主要实验试剂

1.1.2 主要实验仪器(1) 25cm2培养瓶

1.2实验方法

1.2.1 BMSCs的分离、原代及传代培养

1.2.2 细胞计数

1.2.3 细胞活性检测

1.2.4 细胞冻存和复苏

1.2.5 流式细胞术鉴定 BMSCs的纯度

1.2.6 BMSCs向成骨细胞和成脂细胞诱导分化(多分化潜能)的鉴定

1.3 实验结果

1.3.1 BMSCs的分离、原代及传代培养结果

1.3.2 细胞活性检测结果

1.3.3 BMSCs表面标志物鉴定结果

1.3.4 BMSCs向成骨细胞和成脂细胞诱导分化(多分化潜能)的鉴定结果

1.4 讨论

2 BMSCs诱导分化为神经元样细胞

2.1 实验材料

2.1.1 主要实验试剂

2.1.2 主要实验仪器

2.2 实验方法

2.2.1 玻片预处理

2.2.2 BMSCs定向诱导分化为神经元样细胞

2.2.3 免疫细胞化学法鉴定神经元样细胞

2.2.4 统计学分析

2.3 结果

2.3.1 免疫细胞化学法鉴定神经元样细胞结果及数据分析

2.4 讨论

3 结论

参考文献

附录A 缩略词表(Abbreviation)

附录B 文献综述:间充质干细胞移植治疗帕金森病的作用机制研究进展

在学研究成果

致谢