富营养化沉积物生物修复及生物扰动对微生物群落结构的影响

摘要

近年来，由于长江口陆源高营养盐水体的输入以及滩涂水产养殖废水的排放，江苏南部近岸滩涂沉积物中氮、磷等营养盐含量大幅度上升，呈现出富营养化的趋势，沉积物中的生物群落结构多样性也出现降低趋势。滩涂沉积物富营养化已逐渐引起学术界的广泛重视，国内外学者对沉积物富营养化生境修复进行了一系列的探索研究。本研究结合生物扰动、物理扰动及微生物强化技术，利用反应曲面和正交设计方法，对三种技术的修复效果进行拟合，探索组合后的氮磷去除效果，并对江苏近岸典型滩涂沉积物进行了氮、磷去除研究，为富营养化滩涂沉积物的生物修复研究提供了基础资料和应用参考；在滩涂实地环境条件下，研究了底栖动物对沉积物中总氮（Total Nitrogen，TN）、总氮（Total Phosphorus，TP）及微生物群落结构的影响，比较了贝类和沙蚕两种不同生物的扰动行为所引起微生物群落结构的差异，探讨了文蛤肠道与沉积物中微生物群落结构之间的关系，为滩涂沉积物生物扰动的作用机制研究提供了基础研究资料。 1.修复用菌株的分离、筛选、鉴定及能力测试 从沉积物中分离鉴定了两株好氧反硝化功能细菌MD5和MD8，对其在有氧条件下的反硝化能力及其相关影响因子进行了分析。通过形态学、16S rRNA序列比对、系统发育分析及亚硝酸盐还原酶功能基因（nirS）鉴定，确定两株好氧反硝化细菌，MD5为盐单胞菌属Halomonas细菌，MD8为产碱杆菌属Alcaligenesx细菌，两株菌的16S rRNA序列GenBank注册号分别为KM362826和KM406394。MD5和MD8在有氧条件下，在以NH4+-N为唯一氮源时，硝化率和反硝化率分别达到81%和88.3%；在以NO3--N为唯一氮源时，硝化率和反硝化率分别达到85.3%和92.1%；在NH4+-N和NO3--N都存在的条件下，总无机氮的去除率达到72%和76.8%。pH值、盐度和碳氮比（C/N）等因子对菌株MD5和MD8的DIN（可溶性无机氮）、NH4+-N和NO3--N的去除能力具有不同程度的影响。低pH值条件下（5.5-6.5），两株菌对 NH4+-N和 NO3--N的去除率都受到显著抑制（p<0.05），硝化和反硝化作用的最佳pH值范围为7.5~8.5；在NaCl质量浓度为10~30 g L-1的范围内，MD5对NH4+-N和NO3--N的去除率随着NaCl质量浓度的增长而增加，MD8的最佳NaCl质量浓度范围稍低于MD5（20~25 g L-1）；在 C/N低于6的条件下，两株菌对 NH4+-N和 NO3--N的去除率都显著降低（p<0.05），MD5比MD8表现出更低的C/N适应范围（8~10）。以上研究表明，MD5和MD8在有氧培养条件下具有较强的硝化―反硝化能力，可应用于海水养殖池塘养殖废水的处理，具有良好的应用潜力。 2.实验室条件下应用反应曲面方法研究四个因子去除营养盐的组合效果 应用反应曲面（Response surface methodology）方法，在实验室条件下对大型底栖动物（文蛤Meretrix meretrix和沙蚕Perinereis aibuhitensis）、物理扰动（翻耕）及微生物强化（反硝化菌株）进行优化组合，进行了沉积物中TN、TP和总有机碳（TOC）的去除效果研究。结果表明，在均衡TN、TP和TOC三者的去除率的条件下，组合文蛤生物量为1.2 kg m-2，翻耕深度为16.4 cm，细菌浓度为0.18 L m-2，沙蚕生物量为0.16 kg m-2时，沉积物中TN、TP和TOC可以达到最大去除率，分别为39%、33%及42%。本研究结果测试了四个因子组合后去除营养盐的效果，为实地修复研究提供了参考资料。 3.实地条件下应用正交方法研究四个因子去除营养盐的组合效果 在实地滩涂条件下采用正交设计方法设置了9组100 m2实验围栏（10 m×10 m），每组围栏组合了不同水平的文蛤生物量、沙蚕生物量、翻耕深度及反硝化细菌添加量，研究了不同因子去除营养盐的组合效果。结果表明，组合文蛤生物量0.8 kg m-2（约73indm-2），物理扰动深度25 cm，反硝化细菌添加量0.2 L m-2，沙蚕生物量0.2 kg m-2（约50ind m-2）可以达到最高TN和TP的去除率，分别为18.46%和18.88%；实验组沉积物间隙水营养盐通量也受到组合因素的影响，明显小于周围沉积物间隙水中的营养盐浓度。由此表明，组合生物扰动、物理扰动及微生物强化的方法可以有效地降低沉积物中TN和TP的含量。 4.生物扰动对沉积物理化特征及微生物群落结构的影响 在实地滩涂环境条件下设置了文蛤扰动实验组、沙蚕扰动实验组以及混合扰动实验组（文蛤和沙蚕），开展了生物扰动对沉积物、空隙水中营养盐特征及沉积物中微生物群落结构的影响研究。结果表明，文蛤扰动实验组、沙蚕扰动实验组及混合扰动实验组对沉积物中的 TN、TP及 TOC具有显著地去除作用（P<0.05），对沉积物间隙水中营养盐和溶解氧的特征也具有显著地影响（P<0.05）。生物扰动后的沉积物微生物群落结构发生了一定程度的变化，但未出现显著性改变（P>0.05）；文蛤扰动实验组、沙蚕扰动实验组及混合扰动实验组沉积物中微生物群落结构之间没有显著性差异。另外，对沉积物中氮循环功能细菌功能基因定量分析发现，生物扰动实验组可以显著地提高细菌的氨加单氧酶功能基因 amoA基因拷贝数量（P<0.05），而古菌的氨加单氧酶功能基因arch-amoA基因拷贝数量未发生显著性提高（P>0.05）。本研究从微生态的角度进一步揭示了生物扰动影响氮循环的机制。 5.文蛤肠道与沉积物中微生物群落结构的相互关系 对文蛤肠道及其栖息环境沉积物中微生物群落结构进行了高通量测序及其氮循环功能基因的定量研究。结果表明，文蛤肠道和栖息环境沉积物中微生物群落结构表现出一定的差异性，但更表现出较高的相似性，其群落结构未出现显著性差异。在文蛤肠道及栖息环境沉积物中微生物群落中都含有较高丰度的氮循环功能细菌。氮循环功能基因－氨加单氧酶（arch-amoA和amoA）的定量研究结果表明，在基因水平上氮循环功能细菌大量存在于文蛤肠道和周围沉积物环境中。由此表明，文蛤在对沉积物的扰动过程中，除扰动作用对沉积物的物理结构、微生物群落及生化反应过程具有显著地影响外，文蛤肠道中的微生物菌群生化过程也可能直接参与沉积物和水体中的氮循环过程，表明文蛤的扰动作用与沉积物氮循环过程具有紧密的相互作用关系。

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引言

第一章 生境修复研究及生物扰动研究进展

一、 我国海洋富营养化趋势及生境修复研究进展

二、 生物扰动对沉积物氮循环及微生物群落结构的影响

第二章 海洋异养好氧硝化―反硝化细菌的筛选、鉴定及能力测试

1. 前言

2. 材料与方法

3. 结果

4. 讨论

第三章 实验室条件下生物扰动、物理扰动及微生物强化的组合作用对沉积物中营养盐去除的研究

1.前言

2.材料与方法

3.结果

4.讨论

第四章 滩涂实地条件下生物扰动、物理扰动及微生物强化的正交组合去沉积物中营养盐去除的研究

1.前言

2.材料与方法

3.结果

4.讨论

第五章 大型底栖动物的扰动作用对沉积物中微生物群落结构的影响

1.前言

2.材料与方法

3.结果

4.讨论

第六章 文蛤中肠道与沉积物中微生物群落结构的关系

1.引言

2.材料与方法

3.结果

4.讨论

参考文献

读博期间研究成果

本研究课题来源

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