中国边缘海沉积物中厌氧氨氧化细菌群落的分子检测

摘要

几十年前，人们发现厌氧氨氧化细菌在海洋氮循环中发挥重要作用。诸多文章通过分析16S rRNA基因及肼氧化酶基因，研究了各种生态系统中厌氧氨氧化细菌群落的多样性、组成、丰度以及环境因子对以上三者的主要影响。中国北部边缘海有着较长的海岸线，同时很多陆源营养物质可显著影响微生物的群落结构，因此这一海域在海洋生态系统的生物地球化学循环中起着重要作用。本论文的第一部分研究了中国北部边缘海四个不同区域的沉积物中厌氧氨氧化细菌的多样性、群落组成及丰度。另外，由于生态及生物地理学重要性显著，以及较高的微生物多样性，相毗邻的东海和黄海也是两个重要的中国边缘海。因此，本论文的第二部分通过16S rRNA基因及肼氧化酶功能基因分析了东海及黄海五个站位沉积物中厌氧氨氧化细菌多样性、群落结构及分布。
　　在对中国北部边缘海的研究中，16S rRNA基因及肼氧化酶基因的克隆文库均表明“Ca.Scalindua”在所研究的站位中是广泛分布的优势属。另外，16S rRNA基因克隆文库还发现四个新属以及两个属于浮霉菌门但与目前已知厌氧氨氧化细菌进化关系较远的种系型，也表明了厌氧氨氧化细菌极高的多样性。四个新属暂时命名为“Ca.Pacificus”、“Ca.Maredium”。其中的五个种暂时命名为“Ca.Maredium asiatica”、“Ca.Marediumpacifica”。肼氧化酶蛋白质序列发现了“Ca.Jettenia”和“Ca.Anammoxoglobus”两个极少在海洋沉积物中出现的厌氧氨氧化细菌属的存在。在所研究的环境因子中，盐度、总有机物、温度三种环境因子影响着厌氧氨氧化细菌分布、群落组成。对16S克隆文库多样性指数和获得的OTU数目的分析显示渤海BS1与BS3站位的厌氧氨氧化细菌的多样性相对较高，而南黄海SYS3站位的多样性最低。同时，对肼氧化酶蛋白质序列的结果分析表明:东海北部如NECS2和渤海BS1站位的沉积物中多样性较高，南黄海SYS3站位沉积物在所有样品中厌氧氨氧化细菌的多样性最低，这与16S rRNA基因克隆文库的结果相吻合。研究区域厌氧氨氧化细菌16S rRNA基因丰度为2.5×105-5.85×105拷贝数/克（沉积物干重）。沉积物中值粒径大小对厌氧氨氧化细菌丰度有正相关关系。因此，16S rRNA基因及肼氧化酶基因进化分析均表明厌氧氨氧化细菌具有高度多样性，并且发现了厌氧氨氧化细菌类群中非常特殊的种系型，同时我们对环境因子与氨氧化细菌分布模式之间的关系也有了一个更为清晰地认识。
　　对东黄海沉积物样品的16S rRNA基因及肼氧化酶基因克隆文库的研究结果表明，东海及黄海研究站位厌氧氨氧化细菌多样性同样很高，同样“Ca.Scalindua”为分布广泛的优势属。16S rRNA基因序列分析表明这些站位中的大部分氨氧化细菌与之前研究发现的Scalindua的大部分亚种进化关系最近。另外，16S rRNA基因的进化分析还发现了一类特殊的Ca.Scalindua种系型，分子鉴定推断其代表着一个新种，建议暂时命名为“Ca.Scalindua flavia”。同时，进化树中有另外三个进化枝支，并与第一部分研究中发现的三个新属一致。根据对16S rRNA基因序列的多样性指数分析的结果，东海样品MT1站厌氧氨氧化细菌的多样性最高，而黄海L06样品的多样性最低。同时，对肼氧化酶蛋白质序列分析表明东海ME3站位厌氧氨氧化细菌的多样性最高，而黄海L06站位的多样性指数最低。与第一部分研究结果相似，我们还利用对肼氧化酶蛋白质序列的分析，在东海样品中发现了另外两个已知的厌氧氨氧化类群——Ca.Jettenia和Ca.Kuenenia。结合环境参数的统计学分析表明，NH4+及PO43-对厌氧氨氧化细菌群落结构及分布模式影响显著。本文的研究结果表明，中国边缘海表层沉积物中厌氧氨氧化细菌生物多样性较高并且存在特殊的种系型，并且这些氨氧化细菌可能与其生境中固定氮的流失有关。

目录

声明

摘要

Abstract

List of Figures

List of Tables

Table of Contents

Chapter 1

1．0 Introduction

1．1 The role of nitrogen cycle

1．1．1 Nitrification

1．1．2 Denitrification

1．2 Anammox bacteria

1．2．1 Habitat and diversity of anammox bacteria

1．2．2 Anammox bacterial phylogeny

1．2．3 Cell growth，physiology and metabolism of anammox bacteria

1．3 Effects of physicochemical parameters on anammox bacteria

1．3．1 Ammonium

1．3．2 Nitrite

1．3．3 Oxygen

1．3．4 Organic matter

1．3．5 Salinity

1．3．6 Temperature

1．4 Detection methods for anammox bacteria

1．4．1 Enrichment of anammox bacteria

1．4．2 Isotope pairing technique

1．4．3 Lipid analysis for anammox detection

1．4．4 Microsensors

1．4．5 Confocal Raman microscopy

1．4．6．Fluorescent in situ hybridization(FISH)

1．5 Molecular methods for anammox bacterial detection

1．5．1 Phylogenetic analysis by 16S rRNA gene

1．5．2 Phylogenetic analysis by functional gene biomarkers

1．5．3 Denaturant gradient gel electrophoresis(DGGE)

1．5．4 Single-strand conformation polymorphism(SSCP)

1．5．5 Terminal restriction fragment length polymorphism(T-RFLP)

1．5．6 Quantitative PCR Analysis

1．5．7 The use of Metagenome

1．6 Introduction to study sites

1．6．1 Marginal Sea of China

1．6．2 Second studied sites(Yellow Sea and East China Sea)

1．7 Significance of study

Chapter 2 Detection of novel phylotypes and diversity，community composition and abundance of anammox Dacteria from sediments of the north marginal seas of China

2．0 Introduction

2．1 Material and Methods

2．1．1 Sampling and physiochemicai analysis

2．1．2 DNA extraction，amplification，cloning，sequencing and phylogenetic analyses

2．1．3 Quantitative PCR assay

2．1．4 Statistical analyses

2．2 Results

2．2．1 Characterization of sediments of study sites

2．2．2 Amplification and identification of anammox bacteria

2．2．3 Anammox bacterial phylogeny by 16S rRNA gene

2．2．4 Anammox phylogeny by Hzo protein sequences

2．2．5 Anammox bacterial diversity and distribution based on 16S rRNA gene and hzo gene sequences

2．2．6 Abundance of anammox bacteria

2．3 Discussion

2．3．1 Anammox bacterial diversity and distribution in sediments of marginal seas

2．3．2 Phylogeny by 16S rRNA gene and hzo gene sequences

2．3．3 Anammox bacterial abundance and community structure

Chapter 3 Molecular detection of Ca．Scalindua flavia and analysis of anammox bacterial community structure in sediments of the East China Sea and Yellow Sea

3．0 Introduction

3．1 Material and Methods

3．1．1 Area description，sample collection and determination of chemical properties

3．1．2 DNA extraction，PCR amplification

3．1．3 Cloning and Sequencing

3．1．4 Phylogenetic analyses

3．1．5 Statistical analyses

3．2 Results

3．2．1 Environmental parameters of studied area

3．2．2 Diversity and phylogenetic analyses of anammox bacteria using the 16S rRNA gene

3．2．3 Diversity and phylogenetic analysis of Hzo protein sequences

3．2．4 Spatial distribution and community structure of anammox bacteria

3．3 Discussion

4．0 General Summary of Thesis

4．1 Conclusion

4．2 Innovations

References

Appendices

Acknowledgement

Biogeographical Sketch

List of Publications