牛粪堆肥中氨氧化细菌和厌氧氨氧化细菌群落的动态研究

摘要

堆肥化是处理农业废弃物最经济有效的方法之一。堆肥过程中氮素转化是在微生物驱动下完成的生化过程，该过程影响着堆肥的进程和堆肥产品质量，因此，研究堆肥过程中氮素转化及相关微生物群落动态至关重要。氨氧化反应是氮素循环的关键环节，但是目前对牛粪堆肥中氨氧化细菌(AOB)群落动态及其与环境因子相关性的研究不足，对于牛粪堆肥中厌氧氨氧化细菌(ANAMMOX)群落动态及其与环境因子相关性的研究更是鲜见报道。本研究采用牛粪和水稻秸秆作为原材料，使用自制发酵罐模拟自然堆肥系统，来研究堆肥过程中的氨氧化细菌和厌氧氨氧化细菌群落动态变化及其与环境因子的相关性。通过聚合酶链式反应-梯度变性凝胶电泳(PCR-DGGE)、构建克隆文库和荧光定量PCR等分子生物学技术来检测堆肥中氨氧化细菌和厌氧氨氧化细菌群落结构的动态变化，采用冗余分析来分析堆肥微生物的群落结构与环境因子的相关性。本研究为进一步分析堆肥过程中氮素损失机制及指导堆肥生产提供理论依据。
　　本研究主要内容包括：⑴堆肥化共进行36d，第4d进入堆肥高温期，在第7d达到最高温65℃，高温期持续8 d(4 d～11 d)。在整个堆肥过程中，pH值始终维持在弱碱性状态下;含水率一直呈下降趋势，在堆肥第36 d降到48.8％; NH4+-N和NO3--N的含量变化呈相反的趋势，NH4+-N呈现先升后降的趋势，并在堆肥高温期达到最大值(1308.4 mg/kg)，随后开始逐渐下降;NO3--N在堆肥初期缓慢上升，在高温期后快速上升，腐熟期达到最大值(475.2 mg/kg)。随着堆肥的进行，种子发芽率指数也在逐渐上升，直到堆肥结束，发芽率已经达85％以上，由此可以证实堆肥已基本腐熟。⑵采用PCR-DGGE和构建克隆文库等分子生物学技术分别来检测堆肥中AOB和厌氧氨氧化菌，在堆肥化过程中，主要检测到了2类AOB:亚硝化单胞菌属（Nitrosomonas）和亚硝化螺菌属（Nitrosospira），而亚硝化螺菌属为AOB的优势菌属;主要检测到了3类厌氧氨氧化细菌:Candidatus Brocadia、 Candidatus Scalindua和Candidatus Kuenenia属，其中，Candidatus Scalindua菌属是厌氧氨氧化细菌的优势菌属。⑶堆肥化过程中，AOB群落多样性指数变化范围在1.9192～2.6718之间，多样性指数随着温度的变化而变化，在堆肥的第7d达到最大值;厌氧氨氧化细菌群落多样性指数变化范围在0.677～2.019之间，在堆肥化初期(0～3d)，厌氧氨氧化细菌群落多样性指数在减小，随后其多样性指数开始增大，在第7d达到了最大值。⑷冗余分析结果显示，在堆肥化的环境因子影响着AOB和厌氧氨氧化细菌群落结构的变化。环境因子与AOB群落结构的相关性大小为T＞NH4+-N＞含水率＞pH＞ NO3--N，其中，温度和铵态氮(p＜0.05)显著影响着对氨氧化细菌群落结构的变化;环境因子与厌氧氨氧化细菌群落结构的相关性大小为T＞NH4+-N＞含水率＞NO3--N＞pH，其中，温度和铵态氮(p＜0.05)显著影响着对厌氧氨氧化细菌群落结构的变化。⑸AOB和厌氧氨氧化菌16SrRNA基因的荧光定量PCR结果显示，在牛粪堆肥过程中，各个堆肥样品的AOB16SrRNA基因拷贝数变化范围在2.96×106～1.10×107 copies·g-1之间，在堆肥第14天AOB数量最多;厌氧氨氧化细菌16SrRNA基因拷贝数变化范围在2.10×106～7.15×108copies·g-1之间，在堆肥第19天数量最多。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 研究背景

1．1．1 农业废弃物堆肥概况

1．1．2 堆肥中氮素转化的过程

1．2 氮素转化微生物研究现状

1．2．1 氨氧化细菌

1．2．2 厌氧氨氧化细菌

1．3 影响堆肥化的环境因素

1．4 堆肥微生物分子生物学检测技术

1．4．1 荧光原位杂交技术

1．4．2 PCR技术

1．4．3 变性梯度凝胶电泳

1．4．4 荧光定量PCR

1．5 多元分析方法

1．6 研究的目的与意义

1．7 技术路线

2 材料与方法

2．1 试验材料

2．1．1 堆肥原材料

2．1．2 取样

2．1．3 实验试剂与仪器

2．2 试验方法

2．2．1 理化性质

2．2．2 DNA提取与纯化

2．2．3 PCR扩增

2．2．4 氨氧化细菌的DGGE分析

2．2．5 厌氧氨氧化细菌克隆文库的构建

2．2．6 基因定量分析

2．2．7 统计分析

3 结果与分析

3．1 理化及生物指标变化

3．1．1 温度变化

3．1．2 pH值变化

3．1．3 含水率变化

3．1．4 氨态氮及硝态氮的变化

3．1．5 发芽率变化

3．2 堆肥样品DNA提取与纯化

3．3 厌氧氨氧化菌16S rRNA克隆文库分析

3．3．1 厌氧氨氧化菌16S rRNA基因PCR扩增

3．3．2 DNA纯化

3．3．3 连接转化

3．3．4 厌氧氨氧化菌16S rRNA基因克隆文库分析

3．3．5 厌氧氨氧化菌16S rRNA基因系统发育分析

3．4 氨氧化细菌DGGE分析

3．4．1 氨氧化细菌基因PCR扩增

3．4．2 氨氧化细菌基因的DGGE及系统发育分析

3．4．3 氨氧化细菌16Sr RNA基因多样性分析

3．5 堆肥微生物与环境因子相关性的分析

3．5．1 厌氧氨氧化细菌群落结构变化与理化参数相关性分析

3．5．2 AOB群落结构变化与环境因子相关性分析

3．6 基因定量分析

3．6．1 厌氧氨氧化菌16S rRNA基因定量

3．6．2 氨氧化菌16S rRNA基因定量

4 讨论

4．1 堆肥中氨氧化菌和厌氧氨氧化菌的多样性分析

4．2 厌氧氨氧化细菌群落结构与环境因子相关性分析

4．3 AOB群落结构与环境因子相关性分析

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文