牛肺泡巨噬细胞microRNA的克隆鉴定及microRNA 21真核表达载体的构建

摘要

microRNA(miRNA)是一类内源性的小分子单链非编码RNA，长度约22nt，广泛存在于真核生物细胞中。成熟的miRNAs是由较长的初级转录物经过一系列核酸酶的剪切加工而产生的，随后组装进RNA诱导的沉默复合体，通过碱基互补配对的方式与靶基因的3'-UTR区结合，并根据互补程度的不同指导沉默复合体降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻译。研究表明，这些miRNA作为一种真核生物体内的重要的调节因子，在生物体内发挥着重要的调节作用，并影响着生物体生命活动的各个方面，目前已证实miRNA参与各种各样的调节途径，包括发育、病毒防御、造血过程、器官形成、细胞增殖和凋亡、脂肪代谢等等。虽然目前通过实验和计算信息学的方法在植物和动物中发现了众多miRNA分子，但是在各个物种中所鉴定的miRNA的数量远不及理论上的饱和值，所以对miRNA的分离鉴定依然是miRNA研究的一个重点和热点。
　　 牛肺泡巨噬细胞是胞内寄生菌(如牛结核分枝杆菌、副结核分枝杆菌等)的主要靶细胞，在胞内寄生菌的发生、发展过程中起着重要的作用，肺泡巨噬细胞的增殖与凋亡对于胞内寄生菌的侵袭与在细胞内存活起着决定性的作用，有关miRNAs在牛肺泡巨噬细胞抗菌机制中的作用尚未见到报道。本研究通过分离纯化牛肺泡巨噬细胞，提取miRNA，构建miRNA cDNA文库，克隆测序牛肺泡巨噬细胞miRNA分子，以期发现在牛肺泡巨噬细胞特异性表达的miRNA分子，为后期研究miRNA分子对牛肺泡巨噬细胞抗菌活性的调节机制打下基础。
　　 研究内容如下：
　　 1、利用从牛肺泡巨噬细胞中分离得到的microRNA分子，构建了两个miRNAcDNA文库，并挑取了438个克隆，测序后，利用NCBI中的Blastn(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)、miRBase数据库(http：//microrna.sanger.ac.uk/sequences/)和牛的基因组数据库(http：//www.hgsc.bcm.tmc.edu/projects/bovine/)对测序结果进行比对分析，共筛选出22个miRNAs，其长度在19-25 bp，个别的长度为16-17bp，都能够在牛基因组中找到相应的位置。
　　 2、首次建立了牛肺泡巨噬细胞miRNA cDNA文库，并从中发现19个新的miRNAs分子，其中有8个miRNAs与人和(或)鼠中的序列完全同源，因此，将它们命名为Bta-miR-141、Bta-miR-187、Bta-miR-191、Bta-miR-448、Bta-miR-589、Bta-miR-873、Bta-miR-463和Bta-miR-562。另外有11个miRNAs在所有miRBase数据库中都没有发现，其功能尚属未知，有待进一步研究。
　　 3、通过对克隆得到的与人和(或)鼠中的序列同源的miRNAs表达簇和靶基因的生物信息学分析，为研究牛肺泡巨噬细胞中microRNA的协同转录(bta-mir-191与bta-mir-425，bta-mir-141与bta-mir-200c位于同一簇上，转录时协同表达)以及网状调控(miR-448和miR-873以编码miR-155的基因为靶点)等提供了有用信息。
　　 4、在对miR-21靶位点的研究中发现，miR-21不仅对细胞的增殖与分化有调控作用，而且与肿瘤的发生、T细胞和B细胞的成熟密切相关，推测其在肺泡巨噬细胞的抗菌机制中起着重要作用。本研究利用线性载体pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR，成功构建了microRNA21真核表达载体。不仅为后续实验奠定了基础，同时也为研究microRNA21在牛肺泡巨噬细胞的抗菌机制以及免疫调控中的作用提供了技术支撑。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：中英文缩略词表

声明

第一章引言

1.1 microRNA

1.2 microRNA的发现方法

1.3本研究的目的和意义

第二章牛肺泡巨噬细胞microRNA的克隆和鉴定及序列分析

2.1实验材料

2.2实验方法

2.3实验结果

2.4讨论与小结

第三章microRNA21真核表达载体的构建

3.1实验材料

3.2实验方法

3.3实验结果

3.4讨论与小结

第四章结论

参考文献

致 谢

附 录

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