用于药物输送的多重刺激响应性共聚物的制备与表征

摘要

近年来纳米药物载体用于抗癌药物的靶向输送被认为是一项很有前景的技术。但是，仅借助肿瘤的高通透性和滞留（EPR）效应输送纳米药物无法满足癌症治疗的要求。随着“智能型”材料的提出，研究者们根据肿瘤细胞微环境与正常细胞的差异，如 pH、温度、氧化还原、酶等，设计了各种刺激响应性的纳米药物载体。这些纳米药物载体在环境刺激下能够通过结构、形貌、理化性质等方面的变化从而实现负载药物的控释。载体的刺激响应性既可以是单一的，也可以是多重的。纳米载体的响应变化既可以是可逆的，也可以是不可逆的。本论文从细胞微环境的内部刺激出发，采用具有优良生物相容性及生物可降解性的载体材料，如聚乙二醇（PEG）、聚己内酯（PCL）以及聚磷酸酯（PPEs），结合各自优点，借助开环聚合和“点击”化学反应，设计合成了具有多重刺激响应性的纳米药物载体，用做抗癌药物的控制释放。
　　本研究分为两个部分：⑴设计合成了新型基于聚磷酸酯的pH/还原双重响应性的核交联纳米粒子，用于紫杉醇（PTX）和阿霉素（DOX）的共同输送。首先，以紫杉醇（PTX）为引发剂，通过一锅法反应，依次引发2-炔丁氧基-2-氧代-1,3,2-二氧磷杂环戊烷（BYP）和2-乙氧基-2-氧代-1,3,2-二氧磷杂环戊烷（EOP）开环聚合，制备一种生物可降解的紫杉醇?聚合物前药（PTX-PBYP-b-PEEP）。然后，加入胱胺，通过巯基-炔“点击”反应对所得聚合物前药进行功能化修饰，使PBYP链段的侧链修饰上羧基。最后，利用羧基与阿霉素盐酸盐（DOX?HCl）的静电作用，包载抗癌药物 DOX，并借助酰胺化反应引入还原敏感型交联剂，形成 pH/还原双重响应性的核交联载药纳米粒子（DOX/CCL NPs）。利用核磁共振氢谱（1H NMR）、核磁共振磷谱（31P NMR）、凝胶渗透色谱（GPC）以及红外光谱（FT-IR）对所得聚合物的结构进行表征。利用透射电镜（TEM）、动态激光光散射（DLS和zeta电位）对所得聚合物自组装行为进行研究。实验结果表明，该功能化聚合物前药可以在水中自组装形成粒径约为147 nm的球形纳米粒子，并可用于静电包载带阳离子型抗癌药物 DOX?HCl。通过荧光分光光度计对DOX/CCL NPs中DOX的含量进行研究发现，DOX/CCL NPs具有较高的载药量（14.6％）和载药效率（73.1%），这可能是核交联结构以及静电作用力共同作用的结果。体外药物释放实验表明，DOX/CCL NPs在正常生理条件下比较稳定，72 h仅释放出约10%DOX；而在酸、10 mM谷胱甘肽（GSH）及共同作用下，药物释放速率明显加快，相同时间内分别释放约30%、45%及65%的DOX。体外细胞毒性测试（MTT法）以及活细胞工作站测试结果表明，DOX/CCL NPs能够被有效内吞进入HeLa细胞，并且在肿瘤细胞微酸性环境以及高浓度GSH作用下实现药物的有效释放，展现出更强的抑制肿瘤细胞增殖的能力。上述实验结果表明，pH/还原双重响应性的DOX/CCL NPs在药物输送以及癌症治疗领域具有广阔的前景。⑵设计合成了一种含双硒的双重刺激响应性的三嵌段共聚物 PCL-PEGSeSe-PCL，用做抗癌药物的控释载体。首先制备两种双官能的小分子单体：N3-SeSe-N3和PA-PEG-PA，其中，PA代表炔丙基；然后借助一价铜催化叠氮和端炔基的环加成反应（CuAAC）制备炔丙基封端的交替共聚物（PA-PEG-alt-SeSe-PA）；分子中的端炔基再与叠氮封端的聚己内酯（PCL-N3）键合，得到具有优良生物相容性的氧化/还原双重响应性的ABA型三嵌段共聚物PCL-PEGSeSe-PCL（缩写为PCESeC）。利用核磁共振氢谱（1H NMR）、核磁共振碳谱（13C NMR）、凝胶渗透色谱（GPC）、红外光谱（FT-IR）以及基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）对所得聚合物的结构进行表征。利用透射电镜（TEM）和动态激光光散射（DLS）对聚合物的自组装行为进行研究。实验结果表明，这种三嵌段共聚物在水中能够自组装，形成粒径约为108 nm的球形纳米粒子，并可用于包载抗癌药物 DOX。此外，PCESeC纳米粒子呈现出快速的氧化/还原响应特性。体外药物释放实验也证明这一点。载药纳米粒子在正常生理条件下比较稳定，60 h释放出约23%的DOX；而在10 mM的谷胱甘肽（GSH）作用下，药物释放速率明显加快，相同时间内释放近72%的DOX。MTT实验结果表明，PCESeC纳米粒子在浓度达到0.2 mg/mL时，L929和HeLa细胞的存活率依然大于90%，没有明显的细胞毒性，表明这种聚合物纳米粒子具有优良的生物相容性；其载药纳米粒子DOX-dSeN表现出一定抑制 HeLa细胞增殖的能力。活细胞工作站测试结果表明， DOX-dSeN能够被高效地内吞进入HeLa细胞，并且在肿瘤细胞高浓度GSH或活性氧作用下实现药物的有效释放，展现出快速药物释放的能力。上述实验结果表明，DOX-dSeN在药物输送以及癌症治疗领域具有广阔的前景。

目录

声明

第一章 前言

1.1 论文研究工作的意义

1.2 “智能型”纳米药物载体

1.3 “点击”化学

1.4 本论文的研究内容

1.5 本论文的创新点

第二章 基于聚磷酸酯的核交联纳米粒子用于构建pH/还原双重响应的药物载体

2.1 引言

2.2 实验部分

2.3 测试与表征

2.4 结果与讨论

2.5 结论

第三章 氧化/还原双重响应性含双硒的PCL-PEGSeSe-PCL共聚物的合成、表征及药物输送的应用

3.1 引言

3.2 实验部分

3.3测试与表征

3.4结果与讨论

3.5 结论

第四章 结论与展望

4.1 结论

4.2 展望

参考文献

攻读学位期间本人发表论文

致谢