G-MDSCs外泌体通过调控Breg细胞减轻小鼠胶原诱导性关节炎发病的实验研究

摘要

目的:制备粒细胞样髓源性抑制细胞（granulocytic myeloid-derived suppressor cells, G-MDSCs）来源的外泌体（exosomes），观察 G-MDSCs 来源的 exosomes（G-exosomes）对小鼠胶原诱导性关节炎（collagen-induced arthritis,CIA）发生发展的影响，研究G-exosomes对调节性B细胞（regulatory B cell，Breg）的调控作用及其可能的机制。 方法 （1）小鼠右下腹皮下注射2×106个 Lewis肺癌细胞，构建肺癌移植瘤模型。磁珠分选荷瘤小鼠脾脏中的 G-MDSCs，于含 10%超离胎牛血清培养液中培养 16-20小时，收集培养上清。超速离心法联合外泌体提取试剂盒制备G-exosomes。利用Western blot检测G-exosomes表面分子，透射电子显微镜观察G-exosomes的形态，纳米颗粒追踪分析检测G-exosomes粒径大小。 （2）将牛 II 型胶原（C-II）与弗氏完全佐剂 1:1 混合，充分研磨至油包水乳化物，取100μg乳化物于小鼠尾根部皮内注射，初次免疫当日为第0天；第21天，将C-II和弗氏不完全佐剂的乳化物再次免疫小鼠，构建CIA模型。在建模期间，第18天及第24天分别通过尾静脉注射100μg G-exosomes。在小鼠发病过程中，观察小鼠发病进程，包括平均关节炎指数（mean arthritis index，MAI）、CIA发病率等；第42天处死小鼠，取足趾关节制作病理切片，HE染色，显微镜下观察关节完整性、炎性细胞浸润等情况；利用流式细胞术（flow cytometry，FCM）检测小鼠淋巴结及脾脏中调节性B细胞、调节性T细胞（regulatory T cell，Treg）、浆细胞（plasma cell）、滤泡辅助性T细胞（follicular helper T cell，Tfh）比例的变化；酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）检测小鼠血清中抗体水平变化。 （3）磁珠分选小鼠脾脏B细胞，按2×106/孔接种于24孔板，分别加入PBS、G-exosomes（60μg/mL）、LPS（10μg/mL）、LPS（10μg/mL）联合G-exosomes（60μg/mL），利用 FCM 检测 Breg 细胞比例的变化；利用实时荧光定量 PCR （ real time quantitative PCR, qRT-PCR）检测B细胞中IL-10mRNA水平变化；利用Western blot检测GSK-3β表达水平、GSK-3β磷酸化水平和CREB磷酸化水平的变化。 结果 （1）磁珠分选的 G-MDSCs 细胞纯度>95%；G-exosomes 表达 CD63 而不表达calnexin，G-MDSCs细胞表达calnexin而不表达CD63；通过透射电子显微镜观察到G-exosomes为圆形或椭圆形的囊状结构，有完整的包膜；纳米颗粒追踪分析显示G-exosomes的粒径分布峰在100nm。 （2）与CIA对照组小鼠相比，G-exosomes组小鼠足趾关节红肿不明显，活动障碍程度不高，平均关节炎指数较低，关节间隙正常，关节滑膜部位有少量炎性细胞浸润。造模第42天处死小鼠，G-exosomes组小鼠淋巴结中Breg细胞比例升高（P<0.05），而脾脏中Breg细胞比例无明显变化；G-exosomes组小鼠淋巴结及脾脏中Treg细胞比例均无明显变化；G-exosomes组小鼠淋巴结中浆细胞比例降低（P<0.05），而脾脏中细胞比例无明显变化（P>0.05）；G-exosomes组小鼠淋巴结与脾脏中Tfh细胞比例均降低（P<0.05）；ELISA检测结果显示小鼠血清中抗体水平明显降低（P<0.05）。 （3）在体外，与PBS处理组Breg细胞比例相比，G-exosomes单独处理组Breg细胞比例出现升高趋势；LPS联合G-exosomes处理组Breg细胞比例高于LPS处理组（P<0.05）；LPS联合G-exosomes处理组B细胞中IL-10mRNA水平明显高于LPS处理组（P<0.001）；LPS联合G-exosomes处理组B细胞中GSK-3β磷酸化水平、CREB磷酸化水平明显高于LPS处理组。 结论 （1）G-exosomes明显减轻CIA疾病进程，这种作用可能与体内Breg细胞的比例增加、浆细胞与Tfh细胞的比例降低、血清中抗体水平降低有关。 （2）G-exosomes体外能够增加Breg细胞比例，其作用可能与GSK-3β磷酸化水平、CREB磷酸化水平上调有关。

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