杉木炭疽病拮抗细菌的筛选及其菌剂研制

摘要

杉木炭疽病(Colletotrichumgloeosporioides)是杉木栽培区的主要发生病害。几乎有杉木的地区就有炭疽病发生，且以低山丘陵地区人工幼林的发生较普遍且严重，常大面积发生。病轻时会导致杉木幼苗的针叶或嫩梢变褐枯萎，严重时常会造成杉木幼林成片的枯黄、枯死，造成了极大的经济损失。目前，对杉木炭疽病的防治主要以化学防治为主，尚无生物防治的报道。本论文从杉木根际土壤中筛选炭疽病菌的拮抗细菌，对防治效果好的拮抗菌株进行了鉴定及发酵条件优化，筛选了能够提高菌株存活率的载体和助剂，研制成水分散性粒剂，并对该菌剂进行了防效研究。
　　 研究结果如下:
　　 (1)杉木炭疽病拮抗细菌的筛选和鉴定。从杉木根际土壤中分离到拮抗细菌55株，通过平板对峙试验和液体发酵试验初筛，筛选到抑菌带宽度大于等于4mm的菌株有11株。进一步通过盆栽活体复筛，最终得到一株对杉木炭疽病有高效拮抗活性的菌株AM53。结合其菌落形态，生理生化特性及16srDNA序列分析，确定菌株AM53是地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis。杉木炭疽病拮抗菌株AM53保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNo.M2012273。
　　 (2)杉木炭疽病拮抗细菌AM53发酵培养基的优化。对菌株AM53的发酵培养基进行单因素试验，得到适宜菌株发酵的培养基:碳源为葡萄糖，氮源为酵母膏和蛋白胨，无机盐为NaCl。以这些培养基组分为自变量，然后以600nm时AM53菌液的OD(opticaldensity)值作为响应目标，使用Design-Expert8.0软件，利用响应面方法(RSM)中的Box-Behnken(B-B)法对实验进行优化分析，得到拮抗菌AM53的最佳培养基配方为:葡萄糖19.80g/L，酵母膏12.16g/L，蛋白胨4.22g/L，NaCl13.13g/L。经3次平行实验，所得实际AM53菌液平均OD值为1.743。
　　 杉木炭疽病拮抗细菌AM53发酵培养条件的优化。单因子试验结果表明，初始pH、培养温度和摇床转速是影响菌株生长及其抑菌率的关键因素，然后采用Box-Behnken法对试验进行三因素三水平设计，并使用Design-Expert8.0软件对试验数据进行优化分析，得出最佳发酵培养条件为:培养温度30.52℃，初始pH8.09，摇床转速184.67r/min。为了便于实际应用，最佳发酵培养条件修正为:培养温度30.5℃，初始pH=8，摇床转速185r/min。经3次平行实验，所得实际AM53菌液平均OD值为1.861。
　　 (3)杉木炭疽病拮抗细菌AM53菌剂的研制。通过生物相容性的测定，载体硅藻土，润湿剂十二烷基硫酸钠(SDS)，分散剂木质素磺酸钠、三聚磷酸钠STPP，粘结剂聚乙烯醇、聚乙二醇、可溶性淀粉，崩解剂氯化钙、硫酸铵、氯化钠，它们对AM53菌株的芽孢萌发和菌落生长没有影响或影响比较小，可以用于下一步试验。以润湿性、分散性、悬浮性、崩解时间等作指标，通过对润湿剂、分散剂、粘结剂、崩解剂等助剂的筛选，最终确定了菌株AM53水分散粒剂的组成及含量，分别为菌株AM53的发酵液原液(＞8.0×1010cfu/ml)，润湿剂十二烷基硫酸钠3.5％，分散剂木质素磺酸钠5％，崩解剂硫酸铵4％，粘结剂聚乙二醇2％，加水量控制在16-20％间，载体高岭土补足100％。通过对该粒剂的保存温度和保存时间研究，初步确定该粉剂可在常温下存放，其贮存时间至少为2-6个月。盆栽试验和林间防效试验表明该菌剂对杉木炭疽病有较好的预防和治疗效果，500倍的菌剂稀释液的防治效果可达75％左右，与化学试剂多菌灵的防治效果相当。

目录

声明

摘要

1 绪论

1．1 微生物源菌剂

1．1．1 微生物菌剂的涵义和特点

1．1．2 防治植物病害的生防菌类型

1．1．3 开发微生物菌剂的发展前景

1．2 水分散性粒剂

1．2．1 水分散性粒剂的发展概况

1．2．2 水分散性粒剂的定义及组成

1．2．3 水分散性粒剂的特点

1．2．4 水分散性粒剂的性能检测与质量控制

1．3 杉木炭疽病的研究进展

1．3．1 杉木炭疽病的研究概况

1．3．2 杉木炭疽病的防治措施

1．3．3 杉木炭疽病的防治存在的问题

1．4 本课题来源、目的意义与研究内容

1．4．1 课题来源

1．4．2 研究目的和意义

1．4．3 主要研究内容

2 杉木炭疽病拮抗细菌的筛选与鉴定

2．1 实验材料

2．1．1 土样来源

2．1．2 供试病原菌

2．2 实验方法

2．2．1 根际细菌的分离

2．2．2 拮抗菌的筛选

2．2．3 拮抗菌的鉴定

2．3 结果与分析

2．3．1 拮抗菌的筛选

2．3．2 拮抗菌的鉴定

2．4 小结

3 杉木炭疽病拮抗菌AM53的发酵条件优化

3．1 实验材料

3．1．1 菌种

3．1．2 仪器设备

3．2 实验方法

3．2．1 菌种活化

3．2．2 种子悬液制备

3．2．3 菌体浓度的测定

3．2．4 拮抗活性的测定

3．2．5 发酵培养基的优化

3．2．6 发酵培养条件的优化

3．3 结果与分析

3．3．1 发酵培养基的优化

3．3．2 发酵培养条件的优化

3．4 小结

4 杉木炭疽病拮抗菌AM53水分散性粒剂的研制

4．1 实验材料

4．1．1 实验药品

4．1．2 仪器设备

4．2 实验方法

4．2．1 水分散性粒剂的制备方法

4．2．2 载体、助剂生物相容性的测定

4．2．3 助剂的筛选及配方优化

4．2．4 AM53菌剂货架期的测定

4．2．5 AM53菌剂的盆栽防效试验

4．2．6 AM53菌剂的林间防效试验

4．3 结果与分析

4．3．1 载体、助剂对AM53芽孢萌发的影响

4．3．2 润湿剂及其用量的选择

4．3．3 分散剂及其用量的选择

4．3．4 崩解剂及其用量的选择

4．3．5 粘结剂及其用量的选择

4．3．6 加水量的确定

4．3．7 配方优化

4．3．8 菌剂的抑菌活性及货架期

4．3．9 AM53菌剂的盆栽防治效果

4．3．10 AM53菌剂的林间防治效果

4．4 小结

5 结论与讨论

5．1 杉木炭疽病拮抗细菌的筛选与鉴定

5．2 杉木炭疽病拮抗菌AM53的发酵条件优化

5．3 杉木炭疽病拮抗菌AM53水分散性粒剂的研制

6 本文创新点

参考文献

附图

攻读学位期间的主要学术成果

致谢