胸膜肺炎放线杆菌内生质粒和温敏复制型质粒的研究

摘要

胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)是巴氏杆菌科中重要的病原菌,它引起猪的一种高度接触性传染呼吸道疾病-猪传染性胸膜肺炎(porcinecontagious-pleuropneumonia,PCP)。该病分布广泛,难以根除,给世界养猪业造成了巨大的经济损失。因此,预防和控制该疾病尤其重要。然而APP血清型众多(目前已经发现有15种血清型),并且不同血清型之间的交叉保护力较低,对该病的预防控制和治疗带来了极大的困难。而且许多国家用大量不同的抗生素来预防和治疗猪传染性胸膜肺炎,致使许多病原菌(包括APP)产生了极强的抗药性,这对该病的预防和治疗更是雪上加霜。现阶段,为了解决APP的预防和治疗问题,需要对APP的毒力因子、毒力相关因子以及膜蛋白和鞭毛等进行分子生物学研究。但研究这些基因和相关因子的前提是要具备相应的遗传操作工具,如穿梭载体,高效的突变体构建平台等,为技术支持。本文主要对APP的遗传操作工具的研究,包括以下两个方面内容:
　　 1.胸膜肺炎放线杆菌内生质粒pHB0503分析
　　 质粒pHB0503分离于2005年的胸膜肺炎放线杆菌地方分离菌株HB0503。大小为15.079kb,含有16个ORF,其中7个是抗性基因(sul2,catA3,aacC2,strA,strB',blaROB-1和aph(3)-I)。对这些抗性基因簇序列的生物信息分析,来研究该抗生素簇的进化和结构组成。实验数据分析表明该质粒可能在来源不同的质粒间,发生了同源重组而形成的。另外,RT-PCR实验证明:两处抗性基因簇的共转录,分别从sul2和blaRoB-1启动子开始地。对该质粒的复制蛋白的分析,有可能在此基础上构建在APP中能稳定复制地穿梭载体和遗传操作系统,为进一步从分子生物学水平研究胸膜肺炎放线杆菌提供技术支持。而且对内生质粒抗性基因的研究,对临床抗生素的使用也有指导意义。
　　 2.胸膜肺炎放线杆菌温敏复制型质粒的构建
　　 PCR定向突变系统是新型的高效遗传操作体系,已经广泛应用于微生物学研究。构建该系统至少需要重组酶系统、抗性基因PCR模版、诱导型启动子、温敏复制型质粒等四大要件。本实验室已经拥有前三大要件,缺乏APP的温敏复制型质粒。为了构建一个APP的温敏复制型质粒,本研究以APP-E.coli穿梭质粒pJN105和pR318为出发质粒,采用低保真度PCR基因扩增和修复系统缺陷型E.coli感受态细胞基因克隆两种途径筛选温敏复制元件,为构建温敏复制载体奠定基础。

目录

文摘

英文文摘

基金项目资助

缩略语表(Abbreviation)

第1章 文献综述

1.1 胸膜肺炎放线杆菌(APP)及其危害

1.1.1 胸膜肺炎放线杆菌的发现史

1.1.2 胸膜肺炎放线杆菌的特征

1.1.3 胸膜肺炎放线杆菌的毒力

1.1.4 胸膜肺炎放线杆菌的危害

1.2 细菌内生质粒的基本特征

1.2.1 质粒的类型

1.2.2 质粒的复制方式

1.2.3 质粒的拷贝数和拷贝数的控制

1.2.4 质粒拷贝数的测定

1.2.5 质粒的不相容性

1.2.6 质粒的不稳定性

1.3 胸膜肺炎放线杆菌的内生质粒

1.4 胸膜肺炎放线杆菌突变体构建方法

1.4.1 自然突变

1.4.2 化学诱变

1.4.3 转座子突变

1.4.4 同源重组

1.5 PCR定向突变系统的研究进展

1.5.1 PCR定向突变系统的组成

1.5.2 PCR定向突变系统的发展

1.5.3 PCR定向突变系统的优点

第2章 胸膜肺炎放线杆菌内生质粒的研究

2.1 研究目的和意义

2.2 实验材料

2.2.1 菌株和质粒

2.2.2 寡核甘酸引物

2.2.3 培养基和抗生素

2.2.4 主要酶以及试剂盒来源

2.2.5 使用溶液及储存液

2.2.6 蛋白质纯化缓冲液

2.2.7 电泳迁移实验缓冲液

2.2.8 其他试剂

2.2.7 主要实验仪器

2.3 实验方法

2.3.1 APP药敏实验

2.3.2 抗菌药物最低抑菌浓度(MIC)

2.3.3 DNA的操作

2.3.4 RNA的操作

2.3.5 质粒的转化及转化子的鉴定

2.3.6 胸膜肺炎放线杆菌内生质粒序列拼接、测序和注释

2.3.7 质粒拷贝数的鉴定

2.3.8 质粒稳定性研究

2.3.9 质粒消除菌株的筛选

2.3.10 蛋白质操作

2.4 结果和分析

2.4.1 APP的抗药性分析和APP质粒的提取

2.4.2 质粒PHB0503的拼接和测序

2.4.3 内生质粒pHB0503的概述

2.4.2 内生质粒pHB0503序列的分析

2.4.3 内生质粒pHB0503的抗性基因来源和共转录分析

2.4.5 内生质粒pHB0503拷贝数和稳定性

2.4.6 质粒pHB0503的复制蛋白的分析

2.5 讨论

2.5.1 胸膜肺炎放线杆菌耐药性

2.5.2 pHB0503抗性基因簇的来源

2.5.3 质粒pHB0503的稳定性

2.5.4 pHB0503复制蛋白和EMSA

2.6 结论与展望

第3章 胸膜肺炎放线杆菌温敏复制型质粒的研究

3.1 研究目的和意义

3.2 实验材料

3.2.1 菌株和质粒

3.2.2 寡核甘酸引物

3.2.3 培养基

3.2.4 主要试剂

3.3 实验方法

3.3.1 细菌PCR模板制备

3.3.3 PCR扩增

3.3.4 质粒的转化及转化子的鉴定

3.3.5 复制原点突变体库的建立

3.3.6 APP的质粒提取

3.3.7 温敏型载体的筛选

3.3.8 质粒的稳定性

3.4 实验结果和分析

3.4.1 pMIDG301复制原点预测、克隆和验证

3.4.2 用低保真Taq DNA聚合酶扩增法筛选温敏型穿梭载体

3.4.3 用修复系统缺陷型菌株(XL1-RED)筛选温敏型穿梭载体

3.5 讨论

3.5.1 pMIDG301的复制区域的分析和验证

3.5.2 筛选温敏型穿梭载体

3.6 结论和展望

参考文献

致 谢

附录