槐耳通过上调肺癌细胞miR-26b-5p的表达抑制细胞增殖,促进细胞凋亡

摘要

目的:从microRNA水平探讨槐耳清膏抑制肺腺癌细胞增殖，促进细胞凋亡的抗肿瘤分子机制。
　　方法:1.利用CFSE染色法和Annexin V-FITC/PI双染验证槐耳的抗肿瘤作用;2.利用基因芯片分析槐耳清膏处理前后肺癌细胞A549 miRNA表达谱的变化;3.利用荧光定量PCR技术检测部分miRNA的变化，来验证芯片结果的准确性，并检测几种肺癌细胞系中miRNA的表达情况;4.目标miRNA的mimic或inhibitor转染A549细胞或槐耳作用后的A549细胞，检测A549细胞增殖、凋亡情况;5.利用生物信息学技术预测miR-26b-5p的靶基因，并用报告基因技术验证miRNA的靶基因;6.利用基因干扰技术敲低miRNA的靶基因，并检测靶基因敲低后，A549细胞增殖、凋亡情况;7.利用western blot检测槐耳作用、miRNAmimic或inhibitor转染后，A549细胞中miRNA靶基因及下游基因的蛋白表达情况。
　　结果:1.槐耳能抑制A549细胞增殖，促进细胞凋亡，并且这种作用具有时间和药物浓度依赖性;2.槐耳清膏作用改变了A549细胞的miRNA表达谱，66种miRNA表达发生变化(fold change＞2)，其中上调和下调的miRNA各有33种;3.槐耳能上调A549细胞中miR-26b-5p的表达，qRT-PCR的结果与芯片结果一致，并且在几种非小细胞肺癌细胞系中，miR-26b-5p均呈低表达;4.转染了miR-26b-5p mimic的A549细胞有明显的抑制增殖，促进凋亡作用，而miR-26b-5p inhibitor的转染能削弱槐耳对细胞增殖的抑制和凋亡的促进作用;5.生物信息学预测EZH2作为miR-26b-5p的靶基因之一，同时在几种非小细胞肺癌细胞系中EZH2均呈高表达，报告基因技术证实EZH2是miR-26b-5p的靶基因;6.在A549细胞中，EZH2的下调能抑制细胞增殖，促进细胞凋亡;7.在槐耳处理或miR-26b-5p mimic转染的A549细胞中，EZH2、β-catenin和bcl-2均下调，而miR-26b-5p inhibitor的转染能逆转槐耳的作用从而上调EZH2、β-catenin和bcl-2。
　　结论:miR-26b-5p通过靶向EZH2参与到槐耳抗肿瘤作用中，槐耳/miR-26b-5p/EZH2途径的发现为槐耳抗肿瘤作用提供了新的分子机制。

目录

声明

摘要

英文缩略语表

前言

1．材料与方法

1．1 主要实验仪器

1．2 实验材料

1．3 实验方法

2．实验结果

3．实验讨论

结语

参考文献

综述 miRNA参与中药抗肿瘤作用的研究进展

附录

致谢