TM4SF1在人乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231中的表达及其对细胞增殖和迁移能力的影响

摘要

背景：
　　乳腺癌是全世界女性最常见的恶性肿瘤，大约占患癌女性的18％。最新统计数据指出，全世界约有120万女性被确诊为乳腺癌。与发达国家相比，我国属于乳腺癌的低发区，但近年来的发病率增长趋势明显，目前约有47万乳腺癌患者。由于早期诊断和治疗方式的改善，越来越多的妇女得以存活，每年死于乳腺癌的绝对人数在逐年下降，其5年生存率约为50%-60%。然而，国内外相关研究报道，侵袭和转移仍然是临床工作中乳腺癌治疗的主要挑战，并是导致治疗失败和患者死亡的主要原因，且现阶段，乳腺癌的转移机制还不完全清楚，加之现有分子靶向药物使用的局限性和耐药的出现，因此，急切需要我们深入探索乳腺癌的转移机制和发现新的靶基因用于乳腺癌的治疗。
　　TM4SF1（Transmembrane-4-L-six-family-member-1）是四次跨膜蛋白L6超家族成员之一，其在肺癌，胰腺癌，前列腺癌，结直肠癌等多种恶性肿瘤组织中呈现异常高表达，而在正常组织及正常血管内皮细胞呈相对低表达，该基因与肿瘤细胞的增殖，粘附，迁移，侵袭和肿瘤血管生成等密切相关。近年来，TM4SF1作为多种恶性肿瘤治疗的新靶点被广泛研究。
　　目的：
　　1.对比研究TM4SF1在人乳腺癌细胞株MCF-7和MDA-MB-231中的表达情况，初步探讨该基因与细胞恶性程度的相关性；
　　2.采用siRNA靶向抑制TM4SF1基因后，分析两种细胞的增殖、迁移能力的变化。
　　方法：
　　采用Real-timePCR（Q-PCR）检测人乳腺癌细胞株MCF-7和MDA-MB-231中TM4SF1mRNA相对表达情况，并以人正常乳腺细胞系MCF-10A中TM4SF1mRNA的表达作为参照；应用TM4SF1-siRNA瞬时转染MCF-7、MDA-MB-231两种细胞株，采用Westernblot方法分析转染效果和TM4SF1蛋白表达情况；CCK-8法和划痕实验分别检测沉默TM4SF1前后2种细胞株增殖能力和迁移能力的变化。
　　结果：
　　1.瞬时转染的效率：特异性转染TM4SF1-siRNA后，沉默组TM4SF1mRNA相对表达量较siNC组和空白对照组明显下降，表明该基因成功被抑制（P<0.01）。
　　2.三种细胞株TM4SF1mRNA的相对表达量：正常乳腺癌细胞株MCF-10ATM4SF1mRNA相对表达量为（0.016±0.004），乳腺癌细胞MCF-7TM4SF1mRNA相对表达量为（1.159±0.218），MDA-MB-231TM4SF1mRNA相对表达量为（1.396±0.199），MCF-7和MDA-MB-231的TM4SF1mRNA相对表达量均高于MCF-10A的表达量（F=150.447，P<0.01）；高度恶性的三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231TM4SF1mRNA相对表达量高于低度恶性的雌激素受体阳性细胞株MCF-7的表达量（P<0.05）。
　　3.Westernblot结果：沉默组TM4SF1蛋白条带明显暗于阴性对照组和空白对照组，表明两种乳腺癌细胞株已成功被转染。
　　4.CCK-8结果：MCF-7细胞沉默TM4SF1基因0h后，siNC组和siTM4SF1组的增殖力分别为：（0.113±0.015）、（0.112±0.010）；24h后，上述实验组的增殖力分别为：（1.074±0.081）、（1.028±0.042）；48h后，上述实验组的增殖力分别为：（1.114±0.061）、（1.021±0.055）；72h后，上述实验组的增殖力分别为：（1.070±0.101）、（0.909±0.075）。MDA-MB-231细胞沉默TM4SF1基因0h后，siNC组和siTM4SF1组的增殖力分别为：（0.110±0.010）、（0.112±0.009）；24h后，上述实验组的增殖力分别为：（1.296±0.072）、（1.199±0.055）；48h后，上述实验组的增殖力分别为：（1.335±0.054）、（1.247±0.071）；72h后，上述实验组的增殖力分别为：（1.261±0.047）、（1.123±0.097）。以上各段时间的siNC组和siTM4SF1组采用两独立样本的t检验，结果均无统计学差异（P>0.05）。
　　5.划痕实验结果：沉默TM4SF1基因24h后，MCF-7siNC组迁移率为（42.359±3.639）%，siTM4SF1组为（23.412±6.397）%，两两比较结果：t=4.459，P=0.011；MDA-MB-231siNC组迁移率为（51.799±5.429）%，SiTM4SF1组为（30.549±5.978）%，两两比较结果：t=4.558，P=0.010。
　　结论：
　　1.TM4SF1在乳腺癌细胞中较正常乳腺细胞呈现相对高表达；
　　2.TM4SF1基因增强乳腺癌细胞的迁移能力，而与细胞的增殖能力相关性无统计学意义；
　　3.TM4SF1可能与细胞的恶性程度正相关。

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英文缩略词索引

前言

材料与方法

1 材料

2 实验方法

结果

1 荧光标记的siRNA（FAM-siRNA）转染效率的检测

2 三种细胞株TM4SF1mRNA的表达

3 MCF-7和MDA-MB-231细胞株中TM4SF1蛋白表达情况及转染效果

4 沉默TM4SF1基因对MCF-7、MDA-MB-231细胞增殖的影响

5 沉默TM4SF1对两种细胞迁移能力影响的实验结果

讨论

结论

参考文献

综述:乳腺癌分子靶向治疗最新进展

个人简历及在研究生期间发表的学术论文

致谢