神经氨酸酶天然产物抑制剂的作用模式研究和虚拟筛选

摘要

流感是由流感病毒引起的呼吸道传染病，具有传播快和发病率高等特点。每年的季节性流感可致30-50万人死亡，而流感的世界大流行曾导致上亿人感染和数千万人死亡。流感病毒是一种正粘病毒科RNA病毒，分为A、B和C三种亚型（或甲、乙和丙型），其中仅A型能引起流感世界大流行。根据A型流感病毒表面的血凝素（HA）和神经氨酸酶(NA)不同，将其命名为HxNy。
　　 由于NA在流感病毒复制中具有重要生物学作用，且其活性口袋在不同亚型流感病毒中具有保守性，NA被作为抗流感病毒药物研发的重要靶点之一。目前，神经氨酸酶抑制剂(NAI)是临床上最有效的抗流感病毒药物，在2013年我国的H7N9禽流感疫情中，3个NAI被作为抗流感病毒的有力武器，分别是口服药奥司他韦（商品名“达菲”）、吸入粉雾剂扎那米韦（商品名“乐感清”）和注射剂帕拉米韦（商品名“力韦”）。
　　 迄今确定的NA亚型有9种，基于系统分析法可将其分为两组，组1包括N1、N4、N5、N8，组2包括N2、N3、N6、N7、N9，两组NA在“150-环”和“150-空腔”处存在明显结构差异。但同属于组1 NA的09N1(来自2009H1N1)在“150-环”处的结构更类似于组2 NA。随着流感病毒的不断变异和耐药性问题的愈演愈烈，加速开发新型、抗耐药性NAI变得刻不容缓，而基于09N1结构的NAI发现和机制探索可能为新型NAI的研发提供新思路。
　　 据统计，在1981-2010年间注册的抗病毒新化学实体中，80％是天然产物及具有天然产物骨架的衍生物，且近年来关于天然产物NAI的研究也远超过化学合成NAI。我国是中药使用大国，在抗流感病毒方面，中药也发挥着重要的作用。为使中药走向国际化，需加速中药现代化进程，而阐明中药发挥药理活性的物质基础和作用机制一直是关键和难点。计算机辅助药物设计(CADD)在阐明分子间相互作用方面有独到之处，可作为从抗流感中药宝库中发掘活性成分并阐明其作用机制的有利工具。
　　 本研究充分利用蛋白数据库(PDB)中有关NA的晶体结构数据，从文献中收集有关天然产物NAI、抗流感中药化学成分等化合物的结构和活性信息，综合运用CADD的多项理论和技术，首先对GOLD和Surflex-Dock这两个分子对接软件的09N1体系对接效果进行评价，然后基于分子对接探讨09N1天然产物抑制剂(天然产物09NAI)的作用模式;构建09N1抑制剂(09NAI)的药效团模型;基于药效团搜索、类药性评价和分子对接对中药化学数据库(TCMD)和自建的抗流感中药化学成分数据库(AICMD)进行虚拟筛选，以发现潜在的新型NAI。
　　 目的:利用分子对接技术，在分子水平揭示天然产物09NAI与NA的作用模式;基于上市药物的结构特征和作用模式，构建09N1抑制剂的药效团模型;构建抗流感中药化学成分数据库(AICMD);对TCMD和AICMD进行虚拟筛选，以得到潜在的新型NAI。
　　 方法:
　　 1、利用分子对接软件GOLD和Surflex-Dock分别将09N1-NAI晶体结构中的配体对接回原09N1，根据对接构象的RMSD值和关键氢键重现率（用KISS Score表示）两个指标来评价分子对接方法的可靠性。
　　 2、收集天然产物09NAI，利用分子对接探讨这些化合物的作用模式以及它们与上市NAI的作用模式异同。
　　 3、依据上市09NAI的结构特征和NA-NAI晶体结构中蛋白-配体间的相互作用，构建09NAI的药效团模型。
　　 4、基于药效团搜索、类药性评价和分子对接等技术，对TCMD进行虚拟筛选。
　　 5、根据文献统计临床和实验研究中抗流感单味药出现频率的高低，依次收集单味药的化学成分，构建AICMD，并对其进行虚拟筛选。
　　 结果:
　　 1、分子对接软件GOLD和Surflex-Dock得到的所有配体对接构象与晶体结构中配体构象的RMSD值都小于2.5(A)，且每个配体的得分最高构象均有较高KISS Score值。以RMSD和KISS Score为评价标准，比较GOLD的两个打分函数Gold Score和Chem Score，发现基于Gold Score所得的对接结果更好。
　　 2、收集了10个天然产物09NAI，分子对接结果显示，它们都与NA活性位点S1区的Arg371、Arg292或Arg118形成氢键或静电作用，从中总结出5个与S1区相互作用的结构片段，即黄酮类母核结构5-羟基色原酮和2-羟基苯乙酮、苯基脂肪酮(苯基与羰基间碳原子数为1～3)、邻苯二酚类和1，3-丙二酮。与其他09NAI不同，化合物katsumadain A主要以范德华力和疏水作用力同NA结合，而不是氢键或静电作用。基于这10个09NAI构建了一个4点药效团模型，包含两个氢键受体，可与S1区形成氢键作用;两个疏水中心，其中一个对应于09NAI的母核结构，另一个疏水中心与氢键受体毗邻，可与“430-环”处残基形成疏水作用。
　　 3、基于4个上市09NAI在结构和作用模式上的异同，构建了4个09NAI的药效团模型，其中一个3点药效团模型（模型1），包含一个氢键受体/负电中心、一个氢键给体/正电中心和一个氢键受体;两个4点药效团模型（模型2和3），除包含3点模型中所有药效特征基团外，还各自包含一个疏水中心或一个氢键受体;一个5点药效团模型(模型4)，包含两个4点药效团模型的所有药效特征基团。
　　 4、从TCMD中筛得50个得分较高的化合物中包含硫苷类、黄酮类、酚类、甜菜黄素类、生物碱类和蒽酮类等结构类型，其中硫苷类化合物得分最高，远超过ZMR。所有化合物都与NA中S1区形成氢键或静电作用，其中与S1区相互作用的结构片段包括硫酸酯基、羧基、黄酮类母核和苯酚结构。值得注意的是，筛得的生物碱AL2主要以范德华力和疏水作用力同NA结合。
　　 5、对临床和实验研究中出现频率最高的4味抗流感单味药甘草、金银花、黄芩和连翘进行了化学成分收集，构建抗流感中药化学成分数据库(AICMD)，其中收录620个化合物。对AICMD进行虚拟筛选，得分排名前25位的化合物中，有12个来自甘草，10个来自连翘，2个来自黄芩，1个来自金银花，化合物的结构类型包含黄酮类、酚类和苯丙素类等。所有化合物都与NA中的S1区形成氢键或静电作用，其中与S1区相互作用的结构片段包括羧基、黄酮类母核和苯酚结构。
　　 结论:
　　 1、本研究表明GOLD和Surflex-Dock对09N1体系的分子对接均具有一定可靠性，在GOLD对接中，宜选择GoldScore作为打分函数，这可为以后09N1体系的分子对接研究提供参考。构建了4个09NAI的药效团模型，其中模型1～3可用于09N1或经典N1抑制剂的虚拟筛选。基于药效团搜索、类药性评价和分子对接技术，采用两种筛选方法，从TCMD中筛得了结构类型互补的潜在NAI，提高了筛选效率，这对大型数据库的虚拟筛选具有启发意义。
　　 2、所构建的抗流感中药化学成分数据库(AICMD)不同于以往数据库，主要用于抗流感有效成分的筛选，一方面为基于CADD的抗流感药物设计提供便利，另一方面有助于加快抗流感中药的物质基础和作用机制研究，具有原创性和实用价值。
　　 3、从TCMD和AICMD中筛得的黄酮类、多酚类和含羧基化合物等具有上市药物或天然产物NAI的结构特征，都是有潜力的NAI。其中牡荆素、(-)-表儿茶精-3-O-没食子酸酯、黄芩苷、木犀草素和木犀草苷具有NA抑制活性，本研究揭示了它们与NA的作用模式。黄酮类化合物F2和木脂素PP3具有抗流感病毒作用，本研究推测它们通过抑制NA来发挥抗流感作用。从甘草中筛得许多含异戊二烯基的黄酮类化合物，它们是潜在的抗耐药性NAI。
　　 4、从TCMD中筛得的硫苷类化合物得分远高于ZMR，从连翘中筛得的2个木脂素PP1和PP2具有类似于ZMR的作用模式，它们都是有潜力的新型NAI。本研究结果将为后续的药理活性实验提供新思路，并为探索抗流感中药的物质基础和作用机制提供线索。
　　 5、分子对接结果显示，本研究收集的所有天然产物09NAI和从TCMD和AICMD中筛得的化合物都与NA活性位点S1区形成氢键或静电作用，这为NAI设计提供了重要启示。本研究总结出6种能与S1区产生作用的结构片段，即5-羟基色原酮、2-羟基苯乙酮、苯基脂肪酮(苯基与羰基间碳原子数为1～3)、邻苯二酚类、1，3-丙二酮和硫酸酯基等结构片段，将为NAI的结构改造提供理论指导。
　　 6、不同于上市NAI，09N1抑制剂katsumadain A和从TCMD中筛得的生物碱AL2主要以范德华力和疏水作用力同NA结合，且都与NA中“245-环”和“430-环”及附近残基形成较强疏水作用;基于10个天然产物09NAI构建的药效团模型中，有一个疏水中心可与“430-环”处残基形成疏水作用;从黄芩中筛到的黄芩苷可与NA中“245-环”处残基形成疏水作用。因此，本研究表明“245-环”和“430-环”对于新型NAI的设计可能有重要意义，同时也说明结构类型丰富的天然产物NAI具有极大研究价值，有望从中发现新型结构和作用机制的NAI。

目录

声明

摘要

引言

第一部分 神经氨酸酶09N1体系的两种分子对接软件效果评价

前言

技术平台与计算方法

结果

附表

讨论

小结

参考文献

第二部分 09N1天然产物抑制剂与NA的作用模式

前言

技术平台与计算方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第三部分 09N1抑制剂的药效团模型构建与评价

前言

技术平台与计算方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

第四部分 中药化学数据库中09N1抑制剂的虚拟筛选

前言

技术平台与计算方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第五部分 抗流感中药化学成分数据库的构建和虚拟筛选

前言

技术平台与计算方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

结论

综述

致谢

个人简历