玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63与其抗生素生物合成阻断突变株间的DNA多态性分析

摘要

玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63是分离自马铃薯疮痂病自然衰退土壤中的一株拮抗菌。前期研究表明，该菌株及其发酵液对棉花黄萎病菌、黄瓜白粉病菌等多种重要的植物病原真菌具有较强的抑制作用，具有良好的生防应用潜力。通过对玫瑰黄链霉菌Men-myeo-93-63进行微波诱变和硫酸二乙酯诱变，已得到了该生防菌的8株抗生素生物合成阻断突变株DE01，DE02，MV11，MV18，MV21，MV22，MV35和MV40。这些突变株对棉花黄萎病菌、马铃薯疮痂病菌、番茄灰霉病菌等病原菌均已失去了抑菌活性，并且传代稳定。 本文利用AFLP指纹图谱分析技术对Men-myeo-93-63及其8株抗生素生物合成阻断突变株进行了基因组DNA多态性分析。结果表明，38对AFLP引物共产生3142条谱带，其中2362条为多态性谱带，占总带数的75.2％.聚类分析结果表明，Men-myeo-93-63及其8株突变株间的遗传相似系数变化范围为0.52～0.88，说明遗传分化较小。它们被分为了两组，Men-myco-93-63与突变株DE01，MV11，MV22，MV35分在了一组，突变株MV21，MV40，MV18和DE02分在了另一组，Men-myeo-93-63与DE02的相似性最低。 从96对引物中筛选得到了3对引物:E-CA/M-GA，E-GA/M-AC和E-GA/M-AG，分别扩增出254bp，312bp和209bp三条仅在Men-myco-93-63中存在，在8株突变菌株缺失的特异条带，命名为EM254，EM312和EM209.Southern杂交试验表明，特异片段EM254，EM312和EM209都只在Men-myco-93-63的基因组泳道中有杂交信号，且为单拷贝。验证了EM254，EM312和EM209只在Men-myeo-93-63中存在，而在其8株抗生素生物合成阻断突变株中缺失。将这3个片段回收、克隆和测序，成功地将其转化为SCAR标记，可以更加方便地用于分子检测，为从分子水平进行突变株的鉴定提供了简便可行的方法。

目录

文摘

英文文摘

声明

1引言

1.1链霉菌突变体的研究进展

1.2 AFLP标记及特点

1.3分子标记在链霉菌研究中的应用

1.3.1链霉菌分类和系统进化研究

1.3.2基因组多态性研究

1.3.3菌株鉴定

1.4本试验的研究背景、立题依据和意义

2材料与方法

2.1试验材料

2.1.1供试菌株

2.1.2主要仪器设备

2.1.3试验所用试剂

2.1.4供试培养基

2.1.5供试接头及引物

2.2试验方法

2.2.1菌种保存

2.2.2抑菌试验

2.2.3链霉菌基因组DNA的提取

2.2.4模板DNA浓度与纯度检测

2.2.5 AFLP试验程序

2.2.6 AFLP银染检测差异片断的挖带回收、纯化及测序

2.2.7聚类分析

2.2.8 AFLP标记转化为SCAR标记

2.2.9 DNA Southern杂交

3结果与分析

3.1 Men-myco-93-63突变株的抑菌试验

3.2基因组DNA的提取

3.3 AFLP体系的建立

3.3.1模板DNA用量

3.3.2内切酶用量

3.3.3酶切时间

3.3.4预扩增

3.3.5选择性扩增

3.3.6AFLP指纹图谱引物的筛选

3.4菌株的AFLP分析

3.4.1菌株的AFLP DNA指纹图谱及多态性分析

3.4.2聚类分析结果

3.4.3特异条带的获得

3.5差异片断的回收、纯化、克隆和检测

3.5.1差异片断的回收、纯化

3.5.2克隆

3.5.3重组质粒的PCR检测

3.5.4测序结果

3.6特异条带的ORF分析、同源性比较、功能分析及归类

3.6.1特异条带的ORF分析、同源性比较

3.6.2特异条带的功能分析及归类

3.7 AFLP标记转化为SCAR标记

3.8 Southern杂交

4讨论

4.1分子标记技术的选择

4.2关于AFLP体系的建立

4.3 AFLP技术分析菌株基因组差异的可靠性和有效性

4.4 AFLP技术成功地转化为SCAR标记

4.5差异基因与菌株抑菌活性的可能关系

4.6关于Southern杂交Marker的使用

4.7试验中存在的问题及下一步研究方向

5结论

参考文献

附录

在读期间发表的学术论文

作者简介

致谢