磷酸钙骨水泥/聚乳酸-羟基乙酸复合物凝固初期对RAW264.7细胞RANK因子表达的影响

摘要

目的：
　　研究磷酸钙骨水泥(Calcium phosphate cement，CPC)及磷酸钙骨水泥/聚乳酸羟基乙酸(Calcium phosphate cement/polylacticacid-polyglycolic acid，CPC/PLGA)复合物凝固初期的降解规律，探讨其凝固初期对单核巨噬细胞RAW264.7细胞增殖的影响及破骨细胞相关因子RANK表达的作用，从而为进一步阐明PLGA促进CPC降解的机制提供依据。
　　方法：
　　实验一、CPC/PLGA凝固初期对RAW264.7细胞增殖作用的影响及钙磷离子变化
　　1、CPC/PLGA凝固初期对RAW264.7细胞增殖作用的影响实验分组为对照组（RAW264.7细胞）、CPC组（CPC+RAW264.7细胞）、CPC/PLGA组（CPC/PLGA+RAW264.7细胞）。将CPC/PLGA初凝块按分组与RAW264.7细胞共培养。利用四唑盐比色试验(MTT)检测第1、3、5、7、9天时，各组的吸光度值，并绘制生长曲线，计算相对增殖率。探讨CPC及CPC//PLGA复合物凝固初期对单核巨噬细胞RAW264.7细胞增殖的影响。
　　2、CPC/PLGA复合物凝固初期PH值及钙磷离子浓度变化
　　该实验分为无细胞组及细胞组，两组均包含空白对照组、CPC组以及CPC/PLGA组。将调拌好的CPC及CPC/PLGA浆料填入模具，并按照分组放入孔板，加入5mlDMEM完全培养基，在37℃，5％CO2环境中浸提7天，每天换液。在第1、3、5、7d时收集浸提液，检测其PH值。根据PH值检测结果，选择细胞共培养组浸提液，利用全谱直读型电感耦合等离子发射光谱仪(ICP-OES)检测其中钙离子以及磷离子的含量，探讨CPC/PLGA凝固初期PH值及钙磷离子浓度的变化。
　　实验二、CPC/PLGA凝固初期对RAW264.7破骨细胞相关因子RANK的影响
　　实验分组:对照组（RAW264.7细胞）、CPC组（CPC+RAW264.7细胞）、CPC/PLGA组（CPC/PLGA+RAW264.7细胞）。将RAW264.7与调拌好的CPC以及CPC/PLGA共培养7天，收集细胞，提取RNA，通过RT-PCR检测细胞中RANK(Receptor activator of nuclear factor kappaB)的表达;并通过免疫荧光检测细胞中RANK的表达，探讨CPC/PLGA凝固初期对单核巨噬细胞RAW264.7细胞破骨细胞相关因子RANK的作用，为进一步阐明PLGA促进CPC降解的机制提供依据。
　　结果：
　　实验一、CPC/PLGA凝固初期对RAW264.7细胞增殖作用的影响及钙磷离子变化
　　1、CPC及CPC/PLGA凝固初期对RAW264.7细胞增殖作用的影响
　　MTT实验结果显示，RAW264.7细胞在第三天时即达对数生长期，第七天达到生长高峰， CPC组和PLGA组第一天时相对增殖率分别为79.43％和66.67％，随后，两组细胞相对增殖率逐渐升高，CPC组在第9天达到最高值97.83％，CPC/PLGA组在第7天达到最高值94.03％。
　　2、CPC/PLGA复合物凝固初期PH值及钙磷离子浓度变化
　　在无细胞培养浸提液中，各组PH值呈现为:对照组＞CPC/PLGA组＞CPC组。在7天的无细胞培养浸提时间中，浸提液PH值呈现出上下波动的状态。在与细胞共培养浸提液中，各组PH值呈现为随培养时间逐渐降低的趋势。材料与细胞共培养的浸提液钙离子浓度变化的结果显示，对照组中的钙离子在1d、3d、5d、7d时，均显著高于CPC组与CPC/PLGA组（P＜0.05）。材料与细胞共培养浸提液磷离子浓度结果显示，CPC组磷离子浓度在1d、3d、5d、7d最高，均显著高于对照组与CPC/PLGA组（P＜0.05），最高浓度为(0.49±0.08) mmol/L。
　　实验二、CPC/PLGA凝固初期对RAW264.7破骨细胞相关因子RANK表达的影响
　　CPC及CPC/PLGA对RAW264.7细胞RANK基因表达的影响:在1d、3d、5d、7d时间点中，CPC组细胞RANK基因的表达与对照组细胞无明显差异。而CPC/PLGA组细胞在6h、5d时，RANK表达量相对于对照组有显著增高(P＜0.05)，最高值出现在6h时，其RANK基因表达扩增倍数达到95.35±29.43。
　　免疫荧光检测RAW264.7细胞RANK蛋白的表达情况:在6h、3d、5d、7d时，RANK在CPC组及CPC/PLGA组平均荧光密度值均高于对照组（P＜0.05)。
　　结论：
　　1、CPC以及CPC/PLGA凝固初期浸提液对RAW264.7细胞增殖无明显抑制作用。无细胞以及细胞共培养的CPC和CPC/PLGA浸提液PH变化表现出不同的规律，提示RAW264.7细胞可能影响CPC/PLGA浸提液中PH值。在细胞共培养浸提液中，钙磷离子释放规律不同，提示RAW264.7细胞分别对钙磷离子有不同的作用方式。
　　2、CPC/PLGA浸提液能够促进RAW264.7细胞的RANK因子表达上调。

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摘要

前言

实验一 CPC／PLGA凝固初期钙磷离子变化及对RAW264．7细胞增殖作用的影响

1 材料与方法

2 结果

3 附图

4 讨论

5 结论

实验二 CPC／PLGA对RAW264．7细胞破骨相关因子RANK表达的作用

1 材料与方法

2 结果

3 附图

4 讨论

5 结论

全文小结

参考文献

文献综述

致谢

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