红平红球菌复苏促进因子基因克隆、表达及生物学活性研究

摘要

细菌活的非可培养（VBNC）状态是细菌在不良环境下形成的一种休眠方式。在所在环境改善时非可培养细胞复苏为可培养状态，但有关细菌复苏机制并不明确。藤黄微球菌（Micrococcus luteus）细胞复苏促进因子（Resuscitation promoting factor,Rpf）首次被报道能促使休眠菌状态细胞复苏，并刺激正常细胞生长。现已发现复苏促进因子（Rpf）广泛存在于高G+C含量革兰氏阳性细菌中，与细菌生长及抵御不良环境有关。不同种类细菌的Rpf种类和数量有一定差异。红球菌属的细菌广泛分布于岩石、土壤、地下水等自然环境。多数种类在修复石油污染土壤、污水处理等方面有有广阔应用前景。红平红球菌（Rhodococcus erythropolis）KB1分离自石油污染土壤，具有高效石油降解能力和环境适应性。为探索Rpf在红平红球菌适应环境中的作用，本文进行了红平红球菌KB1 Rpf基因克隆、基因结构分析、表达及生物学性质研究，具体内容如下：
　　设计了复苏促进因子基因特异引物，从红平红球菌KB1基因组DNA扩增出4种rpf基因，分别为564、1125、1128和555bp，编码187、353、375和184个氨基酸残基的蛋白质。序列分析发现4种rpf基因分别与藤黄微球菌rpf基因，结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）rpfB、rpfC及链霉菌（Streptomyces coelicolor）rpfB有较高相似性。4个rpf基因编码的蛋白都有一个类似藤黄微球菌细胞复苏促进因子的Rpf域，含有1个保守谷氨酸残基，由大约70个氨基酸组成。其中Rpf-1与结核分枝杆菌、链霉菌RpfC相似，只含1个Rpf结构域，Rpf-2与结核分枝杆菌RpfB相似，含有1个Rpf域、1个G5域和2个DUF348，Rpf-3与链霉菌RpfB相似，含有1个Rpf域、G5域和3个DUF348，Rpf-4与藤黄微球菌Rpf相似，含1个Rpf域和1个LysM域。Rpf-2、Rpf-3含信号肽序列，Rpf-1、Rpf-4不含信号肽。Rpf-1、Rpf-2、Rpf-3和Rpf-4均为亲水性蛋白，含有多个丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸位点，没有组氨酸位点。
　　设计特异表达引物，将红平红球菌KB1 rpf-1基因克隆于原核表达载体pET-32a(+)，在大肠杆菌BL21中高效表达，用Ni琼脂糖亲和层析柱纯化重组蛋白，SDS-PAGE电泳分析表明纯化蛋白分子量为36kDa。用人工合成底物4-Methylumbelliferyl-β-D-N-N’-N’-triacetyl chitotriose检测发现rpf-1具有溶菌酶活性。溶菌酶比活力为2.07U/mg。以偶氮酪蛋白为底物测定了纯化蛋白rpf-1的蛋白酶活性，发现纯化蛋白能水解偶氮酪蛋白，蛋白水解酶比活力为235U/mg。
　　将纯化的重组蛋白Rpf-1添加到不同状态红平红球菌细胞培养物中，发现其对正常生长、VBNC状态及-80℃低温保存的细胞具有明显复苏或促生长作用。添加10%的Rpf-1使低温保存红平红球菌生长速度增长4.8-6倍。添加Rpf-1使正常生长的细菌细胞在12h时入对数期，48h细菌数量达最大，是对照组细菌生长量的3倍。添加Rpf-1重组蛋白使VBNC状态的红平红球菌复苏量增加，48h后细菌生长量是空白对照组的1.44倍。

目录

声明

第 1 章 绪 论

1.1 非可培养状态（ VBNC）状态研究进展

1.2 复苏促进因子（ Rpf）的研究进展

1.3 革兰氏阴性菌的细胞复苏促进因子的研究进展

1.4 石油降解菌红球菌（ Rhodococcus spp.）特性

1.5 本文研究的目的和意义

第 2章 红平红球菌 KB1的 4种细胞复苏促进因子基因克隆及生物信息学分析

2.1 引言

2.2 材料

2.3 方法

2.4 结果

2.5 讨论

2.6 结论

第 3 章 红平红球菌复苏促进因子 Rpf-1 蛋白在大肠杆菌中表达及性质

3.1 引言

3.2 实验材料和仪器

3.3 实验方法

3.4 结果

3.5 讨论

3.6 结论

第 4 章 红平红球菌复苏促进因子 Rpf-1 蛋白对红平红球菌的生长促进作用

4.1 引言

4.2 实验材料和仪器

4.3 重组蛋白 Rpf-1 对菌体的复苏促进作用

4.4 结果

4.5 讨论

4.6 结论

结论

参考文献

致谢

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