N-酰基高丝氨酸内酯酶基因克隆、表达、性质研究与防治鱼类暴发性流行病应用

摘要

N-酰基高丝氨酸内酯酶是一类特异性降解N-酰基高丝氨酸内酯类信号分子(AHLs)的金属水解酶，广泛存在于多种微生物中，近年来作为一种新型抗菌策略(群体感应淬灭策略)的工具酶而成为研究的热点。目前主要是通过构建转基因植物、转基因细菌研究其在群体感应淬灭中的作用机制，而转基因植物或转基因细菌在实际应用中存在生物安全和有效性方面的问题。本研究的目的是毕赤酵母高效表达N-酰基高丝氨酸内酯并将该酶以酶制剂的形式来防治水产养殖中嗜水气单胞菌引起的疾病。首先以3-oxo-C6-HSL为唯一碳源和氮源的筛选培养基通过富集培养的方法从天津武清池塘低泥分离出一株产N-酰基高丝氨酸内酯酶的菌株，经16srDNA鉴定为苏云金芽胞杆菌。通过设计该种属N-酰基高丝氨酸内酯酶的兼并引物，成功克隆了N-酰基高丝氨酸内酯酶基因aiiAB546，aiiAB546片段大小为753 bp，编码250个氨基酸，预测编码蛋白的分子量为28.14 kDa，等电点为4.64，在蛋白的N端预测一个N糖基化位点(Asn-Ser-Thr)。将aiiAB546连接pPIC9表达载体，转化毕赤酵母GS115感受态细胞并成功表达。通过根癌农杆菌KYC 55活性平板法筛选出高效表达的13号菌株。以3-oxo-C8-HSL为底物，在摇瓶水平上该菌株表达的N-酰基高丝氨酸内酯酶酶活为27.1±3.2U/mL，通过3.7L发酵罐高密度发酵，重组蛋白的表达量高达3,5584±81.3 U/Ml，而大肠杆菌表达的酶活仅为0.24 U/mL。毕赤酵母明显提高了N-酰基高丝氨酸内酯酶的表达量，实现了目的蛋白的高效表达。毕赤酵母表达的重组蛋白通过硫酸铵沉淀和阴离子柱纯化出33.6kDa的单一条带。经质谱鉴定为目的蛋白，Endo H处理验证了N糖基化的存在。纯化AiiA的最适pH和温度分别为8.0和20"C，在pH6.5-8.5范围内，酶活性均能维持在80％以上，在0℃，20℃～37℃，AiiA具有60％的酶活力。AiiA具有良好的pH和温度稳定性。在pH6.5-12.0范围内处理60min后，酶活性均高于100％，说明AiiA在中性和碱性条件下非常稳定。AiiA在60℃保温60min，酶活性基本维持不变，70℃保温15min，剩余90％以上的酶活，说明AiiA在60℃和70℃条件下仍非常稳定。AiiA具有非常好的抗胰蛋白酶，α-糜蛋白酶，枯草杆菌蛋白酶，胶原蛋白酶，碱性蛋白酶的能力，AiiA与上述蛋白酶共处理60min，AiiA的酶活性均大于100％。此外，大多数离子对AiiA无抑制作用。AiiA 和嗜水气单胞菌共注射锦鲤可以明显降低嗜水气单胞菌致死锦鲤的平均累积死亡率为25％，延迟了锦鲤的半数致死时间为18h。单独注射锦鲤AiiA，经长时间观察锦鲤生存状态良好。根据实验结果预测AiiA对鱼体无害并且可以降低嗜水气单胞菌致死能力，本实验为潜在机制的研究提供了重要的实验数据。本实验不仅在毕赤酵母中成功高效表达了AiiA，低成本获得大量的AiiA成为可能，而且以酶制剂的形式通过活体注射的方式成功衰减嗜水气单胞菌在锦鲤中的致死能力。根据所知，这是首次在毕赤酵母中高效表达AiiA并通过注射AiiA衰减嗜水气单胞菌的毒力。本实验具有潜在的抗菌策略研究与水产养殖应用方面的价值。