反转录聚合酶链式反应

摘要： 背景:c-Myc是一种众所周知的致癌基因,在许多癌症中过表达.肺泡巨噬细胞是肺脏重要的功能细胞,它不但参与肺脏的免疫防御,吞噬侵入肺脏的细菌颗粒,还可分泌大量生物活性物质,维持肺脏和机体正常的生理功能.超氧化物歧化酶和肿瘤有着密切的关系.目的:观察抗氧化剂超氧化物歧化酶对二氧化硅(SiO2)刺激的大鼠肺泡巨噬细胞培养上清诱导的大鼠肺成纤维细胞增殖及c-myc表达的影响.方法:采用肺泡原位灌洗技术获取肺泡巨噬细胞,①制备条件培养上清:超氧化物歧化酶培养上清(超氧化物歧化酶+肺泡巨噬细胞+不加血清DMEM)、二氧化硅培养上清(二氧化硅+肺泡巨噬细胞+不加血清DMEM)、二氧化硅+超氧化物歧化酶培养上清(二氧化硅+超氧化物歧化酶+肺泡巨噬细胞+不加血清DMEM);分别在培养1,2,4,8,16,32 h不同时间点收取上清;②肺成纤维细胞诱导培养:取第3代肺成纤维细胞,将条件上清与含体积分数5％FBS的DMEM按照1:1比例配制进行诱导,实验分组为:阴性对照组(体积分数2.5％FBS-DMEM培养),阳性对照组(体积分数10％FBS-DMEM培养);超氧化物歧化酶培养上清组;二氧化硅培养上清组;二氧化硅+超氧化物歧化酶培养上清组;培养时间与上述时间点同步进行.采用MTT法、免疫细胞化学法和RT-PCR法分别检测肺成纤维细胞增殖、c-myc蛋白和mRNA的表达情况.实验方案经华北理工大学动物实验伦理委员会批准.结果 与结论:①与对照组相比较,二氧化硅培养上清组能够显著促进成纤维细胞增殖,使c-myc蛋白及mRNA表达水平上调;与二氧化硅培养上清组相比较,二氧化硅+超氧化物歧化酶培养上清组成纤维细胞增殖减少,c-myc蛋白及mRNA表达水平下调(P＜0.05);②结果说明,超氧化物歧化酶能够抑制二氧化硅刺激的肺泡巨噬细胞培养上清介导的肺成纤维细胞增殖和c-myc表达水平的上调.

摘要： 病毒病是引起兰州百合产量下降、品种退化的主要原因,准确、高效的病毒检测技术在百合脱毒种球生产和推广应用中十分重要.根据CMV、LSV和LMoV病毒外壳蛋白基因序列设计引物,以百合18S rRNA为内参照,建立兰州百合病毒RT-PCR、二重RT-PCR检测体系.对兰州百合主栽区病毒病的抽样调查发现,CMV、LSV带毒率分别达到98％、100％,LMoV检出率在不同时期样品中存在较大差异.

摘要： 目的:检测安徽省太和县板蓝根花叶病病原.方法:采用反转录聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)方法,使用黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus,CMV)、蚕豆萎蔫病毒2号(broad bean mosaic virus 2,BBWV2)和马铃薯Y病毒属(Potyvirus)引物对5个板蓝根花叶样品进行分子鉴定.选取2个样品(AH-BLG3和AH-BLG4)的扩增产物进行测序,BLAST分析病原种类及分子特征,根据CMV外壳蛋白(coat protein,CP)氨基酸序列构建系统发育进化树,明确病原的分类地位.结果:5个板蓝根样品均被CMV侵染,未检测到BBWV2和马铃薯Y病毒属病毒.BLASTn分析发现,该CMV板蓝根分离物与我国白术中ZJAm分离物相似度最高,核苷酸相似度分别为98.93％和99.54％,氨基酸相似度均为100％.系统进化分析发现,该CMV板蓝根分离物与ZJAm和Anhui分离物亲缘关系最近,同属CMV IB亚组.结论:明确了安徽省太和县板蓝根花叶病的病原为CMV.

摘要： 为了建立一种适用于临床快速诊断的小反刍兽疫病毒(PPRV) RT-nPCR检测方法,试验依据Gen-Bank公开的PPRV基因序列,针对F基因设计了2对引物,经过反应成分与条件的优化等方法对检测小反刍兽疫病毒的RT-nPCR方法进行了研究.结果 表明:该方法检测的极限为4.362×10-5 ng·μL-1,羊口疮病毒、山羊痘病毒、口蹄疫病毒和蓝舌病病毒检测为阴性,临床28份样品检测结果有4份样品为阳性,阳性率14.3％.说明成功建立了一种高度特异、灵敏的检测PPRV的RT-nPCR方法.

摘要： 中蜂囊状幼虫病是制约中国中蜂养殖产业发展的主要病害.本研究在建立中蜂囊状幼虫病RT-PCR检测方法的基础上,对浙江省淳安县的中蜂进行中囊病的流行病学调查.结果显示:建立的RT-PCR检测方法对中囊病病毒特异性和重复性好,且灵敏度高,检测限为37 fg·mL-1.用建立的RT-PCR检测方法检测淳安县17个乡镇共34个中蜂饲养点的307群工蜂样品,有13个乡镇中囊病病毒呈阳性,其中有6个乡镇阳性检出率超过50％.在中蜂饲养密集和有意蜂混养的地方,中囊病病毒阳性率较高.本研究明确了浙江省淳安县中囊病的流行情况,为该病害的预防和控制提供理论指导.

摘要： 核苷酸转移酶(nucleotidyl transferase protein,NTP)能够对RNA 3’末端进行修饰,从而影响其稳定性.通过分析玉米NTP蛋白家族的结构域与拟南芥、水稻中NTP蛋白进化的关系,发现玉米中含有24种NTP基因,并且玉米、拟南芥和水稻3种植物中的NTP基因具有高度同源性与保守性.对玉米NTP基因启动子上游顺式作用元件进行预测分析,结果显示,玉米NTP基因启动子中含有多个与非生物胁迫相关的启动子元件.通过反转录聚合酶链式反应分析在高盐、干旱、植物激素脱落酸的非生物胁迫条件下,玉米NTP相关基因的表达量,研究发现,玉米NTP基因能被非生物胁迫诱导表达.实验表明玉米NTP基因与非生物胁迫相关,且可能参与了植株抵抗逆境胁迫的过程.

摘要： 本研究旨在比较4种检测猪瘟疫苗效力方法的优缺点.应用用兔效检法、传统RT-PCR检测方法、荧光定量PCR方法、病毒含量检测法等4种方法,分别对3组含有不同猪瘟活病毒含量的试验疫苗进行检测.结果显示,荧光定量PCR方法检出3组试验疫苗平均ct值波动不超过1.1,RT-PCR检测方法在疫苗2倍稀释至2-7时均检出阳性,而用兔效检法和病毒含量检测法检出不同试验疫苗的效力有明显差异.结果表明,荧光定量PCR方法和RT-PCR检测方法无法鉴别出活病毒与死病毒,用兔效检法和病毒含量检测法只能检出疫苗中的活病毒,适用于猪瘟活疫苗的效价检测.

摘要： 本研究旨在比较4种检测猪瘟疫苗效力方法的优缺点.应用用兔效检法、传统RT-PCR检测方法、荧光定量PCR方法、病毒含量检测法等4种方法,分别对3组含有不同猪瘟活病毒含量的试验疫苗进行检测.结果显示,荧光定量PCR方法检出3组试验疫苗平均ct值波动不超过1.1,RT-PCR检测方法在疫苗2倍稀释至2-7时均检出阳性,而用兔效检法和病毒含量检测法检出不同试验疫苗的效力有明显差异.结果表明,荧光定量PCR方法和RT-PCR检测方法无法鉴别出活病毒与死病毒,用兔效检法和病毒含量检测法只能检出疫苗中的活病毒,适用于猪瘟活疫苗的效价检测.

摘要： 本研究旨在比较4种检测猪瘟疫苗效力方法的优缺点.应用用兔效检法、传统RT-PCR检测方法、荧光定量PCR方法、病毒含量检测法等4种方法,分别对3组含有不同猪瘟活病毒含量的试验疫苗进行检测.结果显示,荧光定量PCR方法检出3组试验疫苗平均ct值波动不超过1.1,RT-PCR检测方法在疫苗2倍稀释至2-7时均检出阳性,而用兔效检法和病毒含量检测法检出不同试验疫苗的效力有明显差异.结果表明,荧光定量PCR方法和RT-PCR检测方法无法鉴别出活病毒与死病毒,用兔效检法和病毒含量检测法只能检出疫苗中的活病毒,适用于猪瘟活疫苗的效价检测.

摘要： 本研究旨在比较4种检测猪瘟疫苗效力方法的优缺点.应用用兔效检法、传统RT-PCR检测方法、荧光定量PCR方法、病毒含量检测法等4种方法,分别对3组含有不同猪瘟活病毒含量的试验疫苗进行检测.结果显示,荧光定量PCR方法检出3组试验疫苗平均ct值波动不超过1.1,RT-PCR检测方法在疫苗2倍稀释至2-7时均检出阳性,而用兔效检法和病毒含量检测法检出不同试验疫苗的效力有明显差异.结果表明,荧光定量PCR方法和RT-PCR检测方法无法鉴别出活病毒与死病毒,用兔效检法和病毒含量检测法只能检出疫苗中的活病毒,适用于猪瘟活疫苗的效价检测.

摘要： 本研究旨在比较4种检测猪瘟疫苗效力方法的优缺点.应用用兔效检法、传统RT-PCR检测方法、荧光定量PCR方法、病毒含量检测法等4种方法,分别对3组含有不同猪瘟活病毒含量的试验疫苗进行检测.结果显示,荧光定量PCR方法检出3组试验疫苗平均ct值波动不超过1.1,RT-PCR检测方法在疫苗2倍稀释至2-7时均检出阳性,而用兔效检法和病毒含量检测法检出不同试验疫苗的效力有明显差异.结果表明,荧光定量PCR方法和RT-PCR检测方法无法鉴别出活病毒与死病毒,用兔效检法和病毒含量检测法只能检出疫苗中的活病毒,适用于猪瘟活疫苗的效价检测.

摘要： 本研究旨在比较4种检测猪瘟疫苗效力方法的优缺点.应用用兔效检法、传统RT-PCR检测方法、荧光定量PCR方法、病毒含量检测法等4种方法,分别对3组含有不同猪瘟活病毒含量的试验疫苗进行检测.结果显示,荧光定量PCR方法检出3组试验疫苗平均ct值波动不超过1.1,RT-PCR检测方法在疫苗2倍稀释至2-7时均检出阳性,而用兔效检法和病毒含量检测法检出不同试验疫苗的效力有明显差异.结果表明,荧光定量PCR方法和RT-PCR检测方法无法鉴别出活病毒与死病毒,用兔效检法和病毒含量检测法只能检出疫苗中的活病毒,适用于猪瘟活疫苗的效价检测.

摘要： 目的：建立能快速、特异、敏感的检测并临床应用的兔出血热病毒RT-PCR方法.方法：根据GenBank公布的RHDV序列,设计了3条引物,对引物组合进行了筛选,优化PCR体系各反应条件,测定该方法的敏感性与特异性,并进行临床应用对比实验.结果：筛选出的引物组合能够特异性扩增331bp产物,Mg2+离子浓度在1.0～1.5mmol/L扩增效果最好,退火温度在50～60°C之间扩增无差异性;该方法可以扩增102拷贝以上的模板,对兔轮状病毒与水泡性口炎病毒检测结果均为阴性;临床应用对比实验显示,该方法自27份临床采集样本较HA方法多检出3例RHDV阳性样本,检出阳性率由66.7％提升至77.8％.结论：本研究建立的RT-PCR诊断方法具有特异、灵敏、快速等特点,能够用于该病的临床检测,为防控该病提供了技术保障.

摘要： 目的：建立能快速、特异、敏感的检测并临床应用的兔出血热病毒RT-PCR方法.方法：根据GenBank公布的RHDV序列,设计了3条引物,对引物组合进行了筛选,优化PCR体系各反应条件,测定该方法的敏感性与特异性,并进行临床应用对比实验.结果：筛选出的引物组合能够特异性扩增331bp产物,Mg2+离子浓度在1.0～1.5mmol/L扩增效果最好,退火温度在50～60°C之间扩增无差异性;该方法可以扩增102拷贝以上的模板,对兔轮状病毒与水泡性口炎病毒检测结果均为阴性;临床应用对比实验显示,该方法自27份临床采集样本较HA方法多检出3例RHDV阳性样本,检出阳性率由66.7％提升至77.8％.结论：本研究建立的RT-PCR诊断方法具有特异、灵敏、快速等特点,能够用于该病的临床检测,为防控该病提供了技术保障.

摘要： 目的：建立能快速、特异、敏感的检测并临床应用的兔出血热病毒RT-PCR方法.方法：根据GenBank公布的RHDV序列,设计了3条引物,对引物组合进行了筛选,优化PCR体系各反应条件,测定该方法的敏感性与特异性,并进行临床应用对比实验.结果：筛选出的引物组合能够特异性扩增331bp产物,Mg2+离子浓度在1.0～1.5mmol/L扩增效果最好,退火温度在50～60°C之间扩增无差异性;该方法可以扩增102拷贝以上的模板,对兔轮状病毒与水泡性口炎病毒检测结果均为阴性;临床应用对比实验显示,该方法自27份临床采集样本较HA方法多检出3例RHDV阳性样本,检出阳性率由66.7％提升至77.8％.结论：本研究建立的RT-PCR诊断方法具有特异、灵敏、快速等特点,能够用于该病的临床检测,为防控该病提供了技术保障.

摘要： 目的：建立能快速、特异、敏感的检测并临床应用的兔出血热病毒RT-PCR方法.方法：根据GenBank公布的RHDV序列,设计了3条引物,对引物组合进行了筛选,优化PCR体系各反应条件,测定该方法的敏感性与特异性,并进行临床应用对比实验.结果：筛选出的引物组合能够特异性扩增331bp产物,Mg2+离子浓度在1.0～1.5mmol/L扩增效果最好,退火温度在50～60°C之间扩增无差异性;该方法可以扩增102拷贝以上的模板,对兔轮状病毒与水泡性口炎病毒检测结果均为阴性;临床应用对比实验显示,该方法自27份临床采集样本较HA方法多检出3例RHDV阳性样本,检出阳性率由66.7％提升至77.8％.结论：本研究建立的RT-PCR诊断方法具有特异、灵敏、快速等特点,能够用于该病的临床检测,为防控该病提供了技术保障.

摘要： 本发明公开了一种能鉴别猪瘟疫苗毒株和流行毒株反转录-复合套式聚合酶链式反应诊断试剂盒，由反转录混合液、一扩混合液、二扩混合液、阴性对照和阳性对照组成。还公开了该试剂盒的检测方法。该方法针对猪瘟病毒NS5B基因设计5条引物，S1、S2为疫苗毒株与流行毒株外扩通用引物，S3、S4为疫苗毒株与流行毒株内扩通用引物，S5为疫苗株内扩特异性引物。经过引物浓度、聚合酶浓度、退火温度等优化，建立了鉴别诊断方法。本发明方法灵敏度高，特异性好，既能检测出流行毒株感染，又能判断是否是疫苗接种阳性，结果直观准确，适用于大范围猪瘟疫情普查诊断，避免误诊造成的损失。

摘要： 本发明公开了一种能鉴别猪瘟疫苗毒株和流行毒株反转录-复合套式聚合酶链式反应诊断试剂盒，由反转录混合液、一扩混合液、二扩混合液、阴性对照和阳性对照组成。还公开了该试剂盒的检测方法。该方法针对猪瘟病毒NS5B基因设计5条引物，S1、S2为疫苗毒株与流行毒株外扩通用引物，S3、S4为疫苗毒株与流行毒株内扩通用引物，S5为疫苗株内扩特异性引物。经过引物浓度、聚合酶浓度、退火温度等优化，建立了鉴别诊断方法。本发明方法灵敏度高，特异性好，既能检测出流行毒株感染，又能判断是否是疫苗接种阳性，结果直观准确，适用于大范围猪瘟疫情普查诊断，避免误诊造成的损失。

摘要： 猪蓝耳病病毒实时荧光反转录-聚合酶链式反应检测方法，其包括以下步骤：（1）设计针对猪蓝耳病病毒的的引物、探针，并在探针上标记好FAM和TAMARA荧光基团；（2）设计针对猪蓝耳病病毒靶序列的内标序列和内标探针，并在探针上标记好HEX和TAMARA荧光基团；（3）配制一步法反转录-聚合酶链式反应病毒核酸检测体系；（4）选定反应条件及程序，上机检测。本发明在一步法反转录-聚合酶链式反应体系内设置了阳性内对照（内标）,可有效监测待测样本中是否具有聚合酶链式反应抑制物，避免聚合酶链式反应假阴性。

摘要： 本发明提供了一种用于反转录聚合酶链式反应试剂盒的阳性对照组合物及其制备方法，其特征在于以一种非靶病毒作为阳性对照，同时设计一对引物，进行扩增，扩增的片段长度与反转录聚合酶链式反应试剂盒的目的基因的长度相同；非靶病毒用异硫氰酸胍灭活。本发明方法制备的阳性对照安全，避免了现有技术中直接使用病毒感染材料造成病毒扩散，且作为RNA病毒的反转录阳性对照，起到了RNA提取、RNA反转录过程对照的作用，证明RNA提取试剂、反应体系中所用物质的活性正常，便于作为商品化试剂盒的阳性对照，具有很高的实用价值。

摘要： 一种含持家基因的双重反转录聚合酶链式反应方法。设计引物使目标基因扩增产物比持家基因扩增产物解链温度低，或目标基因引物比持家基因引物解链温度高，通过控制前期循环的变性温度或退火温度，使持家基因扩增流产而目标基因经扩增得到富集。当目标基因模板数量与持家基因相当时控制变性或退火温度使持家基因也开始扩增，最终目标扩增产物量与持家基因扩增产物量趋于接近。

摘要： 本发明提供一种反转录聚合酶链式反应的方法，其主要包括以下步骤：准备毛细管，将反转录反应所需的反转录酶加入毛细管中，经过预冻干燥程序，在该毛细管内制成反转录冻干反应剂，由此，在使用时可将RNA检体、缓冲液、聚合酶与引物溶液直接加入该毛细管中，与反转录冻干反应剂混合进行回溶，使反转录反应与聚合酶链式反应可一并于毛细管内进行，因而有助于提高实验流程的便利性。

摘要： 本发明提供了一种用于反转录聚合酶链式反应试剂盒的阳性对照组合物及其制备方法，其特征在于以一种非靶病毒作为阳性对照，同时设计一对引物，进行扩增，扩增的片段长度与反转录聚合酶链式反应试剂盒的目的基因的长度相同；非靶病毒用异硫氰酸胍灭活。本发明方法制备的阳性对照安全，避免了现有技术中直接使用病毒感染材料造成病毒扩散，且作为RNA病毒的反转录阳性对照，起到了RNA提取、RNA反转录过程对照的作用，证明RNA提取试剂、反应体系中所用物质的活性正常，便于作为商品化试剂盒的阳性对照，具有很高的实用价值。

摘要： 本发明涉及一种用于柑桔衰退病毒的一步法实时荧光定量反转录聚合酶链式反应固相化检测试剂盒及利用该检测试剂盒检测柑桔衰退病毒的方法，是专门针对柑桔衰退病毒建立的一种荧光定量检测方法和产品。检测时间仅需4h，特异性强、灵敏度高、稳定可靠。该方法克服了现有对柑桔衰退病毒依据症状学的常规诊断方法误判率较高、血清学方法灵敏度低等缺点，适合于柑桔种苗和传毒媒介昆虫的带毒状况的快速诊断，可以用于柑桔种苗质量检验和衰退病毒病的鉴别。

摘要： 一种含持家基因的双重反转录聚合酶链式反应方法。设计引物使目标基因扩增产物比持家基因扩增产物解链温度低，或目标基因引物比持家基因引物解链温度高，通过控制前期循环的变性温度或退火温度，使持家基因扩增流产而目标基因经扩增得到富集。当目标基因模板数量与持家基因相当时控制变性或退火温度使持家基因也开始扩增，最终目标扩增产物量与持家基因扩增产物量趋于接近。