原生质体融合

摘要： 无核柚新品种--华柚3号“华柚3号”是以“国庆1号”温州蜜柑为愈伤亲本,沙田柚为叶肉亲本经原生质体融合再生的二倍体雄性不育胞质杂种。2021年10月获农业农村部植物新品种授权。该品种果实梨形或葫芦形,果形指数大,浅黄色,果面沟纹无、粗糙,果面油胞凸、密度高;果顶部平或微凹,有不整齐印圈;收获季节花柱脱落,果实基部平,有环状印圈,内有放射沟纹。

摘要： 浙江大学农业与生物技术学院杨景华教授团队系统地介绍了蔬菜作物中主要的细胞质雄性不育类型,以及通过自然突变、种间或种内杂交转育和原生质体融合等几种常见细胞质雄性不育系的应用途径;又从线粒体基因组特征角度出发,分析了细胞质雄性不育基因ORFs通过线粒体基因组重组的演化形成机制,以及ORFs的拷贝数变异与育性变异的关系。

摘要： 为从源头上治理蓝藻问题,对本文作者课题组筛选出的高效溶藻菌R1和脱氮聚磷菌B8进行原生质体融合后得到5株融合菌。以蓝藻优势藻种——铜绿微囊藻为受试对象,以溶藻率、脱氮率、除磷率作为评判标准,优选出其中1株兼备溶藻、脱氮、除磷菌株(命名为HL),运用底物抑制Haldane模型构建菌株降解铜绿微囊藻动力学模型。不同方式处理菌液来判定菌株的溶藻作用组分,并用扫描电镜观察其溶藻效果,辅以三维荧光、傅里叶红外初步探寻其溶藻机理。试验结果表明:菌株HL具有高效溶藻、稳定脱氮除磷能力;在菌藻共生环境中,对不同浓度铜绿微囊藻的降解过程符合Haldane方程,其最大比生长速率μ_(m)为1.046d^(-1),半饱和常数Ks为896.92mg/m^(3),抑制常数K为1568.95mg/m^(3),这表明菌株HL对铜绿微囊藻具有较好的耐受与降解能力;菌株HL通过分泌芳香族氨基酸等活性物质,对藻细胞壁破坏,从而导致藻细胞破碎死亡。

摘要： Lager酵母作为最重要的工业微生物之一,是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和真贝酵母(Saccharomyces eubayanus)之间的自然杂交产生的。其在啤酒酿造中的成功是由于其继承了亲本中能利用麦芽三糖和耐低温两种不同的特性。自然杂交产生的其他酵母也应用于特色啤酒及其他酒类的酿造。因此基于杂交优势来选育酵母成为一种选择。啤酒酵母的杂交育种已经有几十年的历史,应用场景主要是提升性能和增加风味,具体的方法有孢子杂交、罕见杂交和原生质体融合等。最近的研究将几种方法应用于啤酒酵母尤其是人工产杂交生新的Lager酵母中,获得了一系列各具特色的杂交种。

摘要： 研究旨在优化嗜酸乳杆菌和地衣芽孢杆菌的原生质体制备工艺来获得融合子,为产芽孢乳酸菌的育种和改良提供新的思路.通过单因素试验考察菌龄、溶菌酶浓度、酶解温度和时间对原生质体形成率和再生率的影响,并在此基础上,以原生质体形成率为指标,通过正交试验优化原生质体制备工艺.结果表明,菌龄和酶解时间对原生质体形成率影响较大,其次为酶解温度和溶菌酶浓度.嗜酸乳杆菌原生质体制备的最优工艺为取培养12 h的对数生长中后期菌体用5.0 mg/mL溶菌酶37°C酶解30 min;地衣芽孢杆菌则取培养8 h(对数生长中后期)的菌体用2.5 mg/mL溶菌酶37°C酶解3 h.在上述条件下制备亲代细胞的原生质体,以PEG6000促融,嗜酸乳杆菌和地衣芽孢杆菌的原生质体融合率分别为4.6×10-6和3.8×10-6.原生质体制备工艺的优化是嗜酸乳杆菌-地衣芽孢杆菌融合子制备及获得高融合率的关键,融合子的获得可为筛选既能形成芽孢又可产蛋白酶和淀粉酶的高性能乳酸菌菌株奠定基础.

摘要： 药源微生物作为微生物药物的生产菌种,其性状好坏直接关系到目标产物的产量与品质,对药物的高效率制备极其重要.因此,药源微生物菌种在生物制药中占据着重要地位.药源微生物的育种技术已从常规的自然育种发展到诱变育种、原生质体融合育种及基因工程育种,改良甚至改变菌种遗传特性,大大提高了药源微生物育种的效果.文章针对药源微生物遗传育种的技术方法,结合各种育种技术的理论机理及应用,简要概括了国内外对药源微生物遗传育种技术的研究概况,并对其发展前景进行了展望.

摘要： 为了培育出具有优良互补性状的平菇和杏鲍菇新菌株,以高产、抗杂能力强的平菇品种CCEF89和优质、适应性强的杏鲍菇品种PL7为亲本菌株,建立原生质体聚乙二醇(PEG)融合体系,得到最佳融合条件:两亲本原生质体数量按1:1混合,30％PEG 6000,0.01 mol·L-1 Ca2+,32°C水浴30 min,融合率达0.0101％ ～0.0282％.通过拮抗反应试验和Rep-PCR分子鉴定,从515个融合再生菌株中获得12个融合菌株P1～P12;出菇试验表明,P1和P5为杏鲍菇新菌株,其他为平菇新菌株.P1和P5的产量、生物学效率均显著高于其亲本菌株PL7,并且抗杂能力显著提高;与亲本菌株CCEF89相比,平菇新菌株P4、P10和P11长满培养料和形成原基的时间缩短5.5～7.3 d,第1茬平均产量提高18.0％ ～24.0％,总生物学效率提高21.00％ ～27.67％.利用原生质体融合技术培育出了具有亲本优良互补性状的平菇和杏鲍菇新菌株,为同时进行2种不同食用菌的种质资源创新和新品种选育提供了一种新途径.

摘要： 旨在获得纳豆芽孢杆菌和暹罗芽孢杆菌种间融合高产Surfactin的新菌株.以纳豆芽孢杆菌和暹罗芽孢杆菌为亲本菌株,通过制备纳豆芽孢杆菌和暹罗芽孢杆菌的原生质体,采用PEG介导的双亲灭活标记法融合原生质体,拟融合子通过PCR鉴定、CPC-BTB法高通量筛选、HPLC复筛以及融合菌株的稳定性验证获得高产Surfactin的新菌株.研究结果表明纳豆芽孢杆菌和暹罗芽孢杆菌的原生质体制备最佳酶解浓度分别为0.25 mg/mL和0.2 mg/mL,最佳酶解时间分别为25 min和20 min,其原生质体得率分别为83.1％ 和84.3％.两者的原生质体融合条件为:纳豆芽孢杆菌紫外灭活80 min,暹罗芽孢杆菌85°C热灭活40 min,融合体系为50％ 的PEG6000在38°C下融合时间15 min.获得了遗传稳定的融合菌株F8,该菌株Surfactin产量相对于纳豆芽杆菌提高了33.3％,暹罗芽孢杆菌提高了60％.

摘要： 为了增强雨生红球藻的异养生长能力,提高规模化培养效率,本研究基于PEG介导的原生质体融合技术,在雨生红球藻SCCAP K-0084和小球藻SAG211.11a间开展了细胞融合以及糖异养融合子筛选研究,筛选中通过限制性糖异养条件和添加潮霉素分别抑制野生型的雨生红球藻和小球藻的生长,提高筛选效率.结果 表明,小球藻SAG211.11a具有极强的异养生长能力,能够利用葡萄糖、果糖、乙酸钠、甘油、苹果酸以及琥珀酸进行异养生长,而雨生红球藻则仅能够利用乙酸盐进行异养生长,此外雨生红球藻SCCAP K-0084还具有极强的潮霉素耐受能力,可以被应用于融合子筛选中.研究中,雨生红球藻和小球藻的原生质体制备效率分别达到72.11％±3.94％和42.07％±3.73％,满足细胞融合需要,融合过程中观察到雨生红球藻和小球藻间的典型融合现象,并且在限制性糖异养筛选下获得了雨生红球藻形态的融合子克隆,融合子的生长速率相比于野生型雨生红球藻有明显的增强,三个融合子在10d培养后细胞密度分别达到6.7×104、8.7×104、6.5×104个/mL,明显高于野生型的2.45×104个/mL,但是相比于小球藻10d后1.4×106个/mL的细胞密度而言,异养生长能力仍然有限,而且在连续传代过程中融合子经常会出现表型分化的现象.这一研究证明,通过细胞融合杂交的方式能够使雨生红球藻获得糖异养的生长能力,但是异源基因组间重组效率有待进一步提高.

摘要： 为创制抗晚疫病的新种质,加快抗晚疫病新品种的选育,同时建立高效的马铃薯叶肉原生质体融合技术体系,应用于马铃薯育种实践.本试验将抗晚疫病的马铃薯二倍体野生种Solanum chacoense与感晚疫病的四倍体材料DY4-5-10进行原生质体融合.结果表明,形成的愈伤数量和形成的完整植株数量都很高,说明该融合组合的基因型的培养效率较高;马铃薯叶肉原生质体融合技术可以创制抗晚疫病新种质。

摘要： @@原生质体融合是一种重要的微生物育种技术。微生物原生质体融合育种技术不但可以改良菌种遗传性状、提高代谢产物量，还可以综合不同菌株代谢特征，产生新的有用代谢产物。与小范围局部的基因重组方式相比较，原生质体融合具有广泛适用性和随机性，能够打破菌株的种属界限，实现远缘菌株间的多细胞融合;还可以和其他育种方法相结合，获得亲本菌种的多种优良性状。原生质体融合在工业生产和遗传育种上展示出广阔的应用前景。

摘要： 考察了双亲灭活条件、聚乙二醇(PEG)相对分子质量、PEG浓度、融合时间、融合温度及无机离子浓度对褐黄孢链霉菌(Streptomyces gilvosporeus)SG-2002-1和SG-2002-2原生质体融合率的影响.分别采用紫外灭活和热灭活法,灭活条件为紫外灭活2 min,热灭活为60°C水浴1 h.原生质体融合最佳条件为:50%的PEG6000,融合温度25°C,融合时间为8 min,CaCl2浓度为0.05 mol/L,MgCl2浓度为0.02 mol/L,在此条件下融合率可达5.0%.

摘要： 本研究以发酵性能优良的酿酒酵母Y1和风味优良的酿酒酵母Y2为亲本菌株，通过对原生质体融合条件的研究，得出以下结论：含2.0mg/mLCuSO4的完全培养基为区别两亲本Y1(n)和Y2(n)的选择性培养基；在最佳酶处理条件下，亲本Y1(n)的原生质体形成率和再生率分别为93.2％和25.8％，亲本Y2(n)的原生质体形成率和再生率分别为93.0％和22.5％；对Y1(n)的原生质体进行60°C，20min水浴灭活，可完全抑制其活性。对融合子酿造蜂蜜桑葚酒的感官品质和主要香气成分进行了分析，最终优选出了融合子Fs；并对融合子F6进行了细胞体积、DNA含量和抗药性能方面的鉴定。结果表明，融合子Fe具有发酵能力强、风味优良的双亲优点，为适合酿造蜂蜜桑葚酒的酵母菌株。

摘要： 为了获得既能代谢葡萄糖又能代谢木糖的酵母菌种，通过原生质体融合技术，以PEG，Ca2+对实验室保存的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)及嗜鞣管囊酵母(Pachysolen tannophilus)进行诱导融合，选育出能够高效利用木糖的融合子。该融合子的获得对木质纤维素水解产物中糖的充分利用打下了良好的基础。

摘要： 目的：以新霉素(Neomycin)标记的ZYD2(NEOs)和YB2(NEOr)作为亲本菌株,培育具有双亲本菌株免疫原性的融合菌株。方法：在溶菌酶作用下,制备两亲本菌株原生质体，聚乙二醇4000诱导原生质体发生融合，利用NEO标记及亲本菌株培养条件不同筛选阳性融合子。结果：ZYD2和YB2可分别得到95.32％和95.25％的原生质体制备率以及32.19％和33.52％的再生率。在含NEO的麦康凯平板上传代培养获得5株稳定遗传的融合菌株。5株融合菌株可同时凝集双亲菌株鸭抗阳性血清。染色镜检观察融合菌株为革兰氏阴性中等大小杆菌。利用双重PCR检测，2株检测到到双亲本菌株部分外膜蛋白A(OmpA)基因和部分外膜蛋白H(OmpH)基因，2株只检测到部分OmpA基因，另1株检测不到任何条带。测序结果表明检测到的部分基因片段与亲本菌株的相关基因片段同源性为100％。微量凝集反应显示，外周血可以检测到双亲本菌株抗体，抗体效价在二次免疫后可以维持较稳定水平。结论：获得5株融合菌株具有双亲本菌株免疫原性且可稳定遗传。

摘要： 反刍兽月形单胞菌是瘤胃内主要的乳酸分解菌，革兰氏阴性菌，能够分解乳酸产生丙酸，约占瘤胃细菌总数的50％以上，生存的最适酸碱度是pH 6.0～6.5。最低耐受pH值为5.4。当反刍动物摄取过量高碳水化物类精料时，乳酸生成菌大量繁殖，由于乳酸生成菌中的乳酸杆菌拥有耐酸相关基因，在瘤胃pH4.5的酸性环境下仍能良好生长，继续生成乳酸。若将其改造成具有耐酸能力的菌株，在酸性环境下能够继续分解乳酸，不仅可降低瘤胃乳酸的蓄积，维持瘤胃内环境的恒定，降低瘤胃酸中毒的发生，而且可增加生糖先质丙酸的生成量，纠正或缓解围产期奶牛能量负平衡。本实验采用原生质体融合技术将反刍兽月形单胞菌与耐酸性强的粘膜乳杆菌进行原生质体融合，构建耐酸的反刍兽月形单胞菌并对其进行鉴定，为研制新型的瘤胃微生态制剂防治围产期奶牛酮病、瘤胃酸中毒等疾病奠定基础。

摘要： γ-聚谷氨酸(γ-PGA)是一种可以通过微生物合成的均聚谷氨酸高分子化合物,在食品、医药、水处理和农业中有广泛的应用前景。为了避免在γ-聚谷氨酸的发酵生产中加入L-谷氨酸,本文探讨将谷氨酸的发酵生产与谷氨酸聚合相耦联,实现直接利用葡萄糖生产γ-聚谷氨酸。首先开展将谷氨酸棒杆菌 Corynebacterium glutamicum S9114 与具有γ-聚谷氨酸合成能力的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ZJU7 进行混合培养,研究了接种量、培养基、温度和溶氧对混合培养体系发酵产率的影响,经过优化最终γ-聚谷氨酸产量达到32.8g·l-1。然后以L-谷氨酸生产菌Brevibacterium flavum和枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ZJU7为亲本,利用原生质体融合技术构建可自身合成和聚合谷氨酸的融和菌株,考察了两亲本的原生质体形成、再生和融合的最优条件,对所获融合子进行了筛选和分析。

摘要： 本文探讨将谷氨酸的发酵生产与谷氨酸聚合相耦联,实现一步法生物合成γ-聚谷氨酸。首先开展将谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum S9114与具有γ-聚谷氨酸合成能力的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ZJU7进行混合培养,研究了种龄、接种量、培养基、温度和溶氧对混合培养体系发酵产率的影响,经过优化最终γ-聚谷氨酸产量达到32.8g/l。然后以L一谷氨酸生产菌Brevibacterium f1avum和枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ZJU7为亲本，利用原生质体融合技术构建可自身合成和聚合谷氨酸的融和菌株，考察了两亲本的原生质体制备、再生和融合的最优条件，对所获融合子进行了筛选和分析。

摘要： 综述了近年来原生质体技术的研究进展及其在果树育种上的应用成果,并讨论了原生质体技术存在的问题及应用前景。

摘要： 本发明提供了一种芥菜原生质体的提取方法及芥菜杂种原生质体的融合方法。所述提取方法包括：使用酶解液将芥菜无菌苗的真叶酶解；所述酶解液由酶液与SCW液组成，所述酶液包括纤维素酶、果胶酶、甘露醇和CaCl2，pH为5.6；所述SCW液包括山梨醇、CaCl2和MES，所述SCW液的pH为5.8；向酶解产物中的上清液中加入W5溶液，离心取沉淀，向所述沉淀中加入含有MES的蔗糖溶液，离心取原生质体沉淀，再向其中加入W5溶液，离心取层析液，所述层析液即为含有所述芥菜原生质体的溶液。本发明克服了提取过程中原生质体量少、易破裂且提取效果不稳定的缺点，并且该方法融合效率比较高，原生质体仍能保持较高的细胞活性。

摘要： 本发明提供了一种芥菜原生质体的提取方法及芥菜杂种原生质体的融合方法。所述提取方法包括：使用酶解液将芥菜无菌苗的真叶酶解；所述酶解液由酶液与SCW液组成，所述酶液包括纤维素酶、果胶酶、甘露醇和CaCl

摘要： 本发明公开了一种马铃薯四倍体栽培种与二倍体野生种原生质体融合方法，通过采用酶解法、界面法分离和纯化马铃薯原生质体，聚乙二醇(PEG)诱导融合法融合四倍体和二倍体原生质体，摸索、优化获得了一套最优的针对参试马铃薯原生质体分离纯化条件、原生质体培养基、愈伤组织再生培养基、四倍体与二倍体原生质体融合方法。并在使用该方法进行的费乌瑞它和野生二倍体材料(E12、E25)融合实验中，得到经DNA进行SRAP分子标记检测的融合株系2个和融合愈伤组织4个；这些材料可作为后续实验材料使用，以确定所获得的融合株系在农艺性状的变化及在生产上的可能应用。

摘要： 本发明公开了一种纳豆芽孢杆菌和暹罗芽孢杆菌原生质体融合的方法，包括如下步骤：两亲株原生质体的制备、菌体的筛选标记、原生质体融合。本发明优化了原生质体制备过程中溶菌酶浓度和酶解时间，以提高原生质体形成率和再生率；并通过采用PEG法与电击法相结合的方法来进行原生质体的融合，优化了PEG的浓度、PEG处理的温度和时间、电击融合的条件和时间等，提高了种间芽孢杆菌原生质体融合率，得到的融合子经过筛选，最终得到高产抗菌脂肽的融合菌株，能广泛应用于生物制药、农业、畜牧业等行业。

摘要： 本发明公开了一种诱导金针菇种内原生质体融合子核分裂和正常形成子实体的方法，包括以下步骤：S1.配制诱导培养基：取麸皮、棉籽混合均匀后加入水，装入玻璃瓶中在高温高压下灭菌处理；S2.接种培养：将培养好的金针菇融合子母种接种在诱导培养基中培养，原生质体融合子核进行分裂；S3.诱导出菇：将接种培养后的金针菇融合子母种进行诱导出菇，形成子实体。本发明通过配制诱导培养基、接种培养和诱导出菇使金针菇原生质体融合子细胞核由1个分裂形成2个细胞核，并能正常形成子实体的，本发明解决了金针菇原生质体进行融合后融合子不能出菇的技术问题，且本发明的方法操作简便、出菇率高、成本低、适用于工业化大规模生产。

摘要： 本发明公开了一种糙皮侧耳和酿酒酵母原生质体的融合方法，是将糙皮侧耳和酿酒酵母制备出的原生质体，然后对糙皮侧耳原生质体进行60°C水浴处理10 min热灭活，酿酒酵母原生质体在距离15W紫外灯20cm处照射230s进行紫外灭活，采用化学融合和电融合。最后从17个融合子中，通过生长速度和木质素降解率的比较，获得了6株生产速度比亲本糙皮侧耳提高1.45‑16.33%左右，木质素降解率提高1.76‑4.16倍的融合子。本发明可以将糙皮侧耳和酿酒酵母原生质体融合。该技术可重复性较强，遗传稳定性好且方法简便属于非转基因育种方式，没有创造新基因，不存在基因污染问题。

摘要： 本发明涉及一种木霉原生质体融合菌株及其应用，木霉原生质体融合菌株为木霉融合子Tpf‑2，其保藏编号为CGMCC No.12477，保藏日期为2016年5月30日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。本发明可以有效防治瓜果腐霉和终极腐霉引起的病害，对由瓜果腐霉和终极腐霉引起的番茄猝倒病的防治效果分别达到了86.3％和85.7％，增产效果分别达到了77.3％和79.9％(p<0.01)，在番茄根际土中定殖5月存活率达到75％，厚垣孢子制剂在1年保质期内有效存活率达到90％。

摘要： 本发明提供了一种利用原生质体融合结合荧光染色筛选融合子选育AA高产菌株的方法。为了获得高产花生四烯酸的高山被孢霉菌株，本发明利用原生质体融合的方法，将两种具备不同优良特性的高山被孢霉进行融合处理，并结合荧光染色方法对融合子筛选。其具体步骤包括：两亲本菌株的培养、两亲本菌株原生质体的制备、两亲本菌株原生质体的荧光染色、两亲本菌株原生质体的融合及融合子的筛选及验证。本发明所述方法操作简单，过程易实现，育种成功几率高。该方法可用于提高花生四烯酸生产菌的产量水平、优化花生四烯酸产品的油脂组分和改良菌种性状等用途。

摘要： 本发明公开了一种纳豆芽孢杆菌和暹罗芽孢杆菌原生质体融合的方法，包括如下步骤：两亲株原生质体的制备、菌体的筛选标记、原生质体融合。本发明优化了原生质体制备过程中溶菌酶浓度和酶解时间，以提高原生质体形成率和再生率；并通过采用PEG法与电击法相结合的方法来进行原生质体的融合，优化了PEG的浓度、PEG处理的温度和时间、电击融合的条件和时间等，提高了种间芽孢杆菌原生质体融合率，得到的融合子经过筛选，最终得到高产抗菌脂肽的融合菌株，能广泛应用于生物制药、农业、畜牧业等行业。

摘要： 本发明公开了一种巨大口蘑和双孢蘑菇的原生质体融合方法。本发明是将巨大口蘑和双胞蘑菇的菌丝体酶解得到原生质体，以巨大口蘑原生质体紫外灭活，双孢蘑菇原生质体热灭活做为标记，采用PEG介导的化学融合方法将巨大口蘑原生质体和双孢蘑菇的原生质体融合，融合子再生，综合验证，获得融合菌株。本发明的方法能够有效将巨大口蘑和双孢蘑菇的原生质体融合，提高选育目的新菌株的成功概率，转化率为80～120％，获得的巨大口蘑新菌株产量高达亩产3000～5000公斤，在8～12°C条件下贮藏30天不变色、不变味，在26～30°C条件下均能生长。