原生质体制备

摘要： 黑曲霉TNA09是高产柠檬酸的工业生产菌株,由于经过多次物理和化学诱变筛选,所以对其进行传统遗传改造非常困难。该试验成功构建黑曲霉TNA09原生质体转化方法,实现该工业菌株的基因工程操作。通过试验得出原生质体制备和再生的最佳条件:取CM斜面培养5 d的新鲜孢子约1×10^(8)个至100 mL马铃薯葡萄糖肉汤(potato dextrose broth,PDB)液体培养基,于37°C、180 r/min摇床培养17 h,取幼嫩菌丝0.70 g至1.50%裂解酶+0.50%蜗牛酶+0.20%溶菌酶的复合酶体系中,37°C处理3.25 h,该条件下原生质体再生率可达36%,并利用聚乙二醇(polyethyleneglycol,PEG)-CaCl_(2)介导的原生质体转化方法一次成功将黑曲霉laeA、cexA基因敲除,为后续的柠檬酸工业菌株的分子改造奠定了坚实基础。

摘要： 总结概括了微藻原生质体制备技术,并对原生质体制备过程中的影响因素进行了深入探讨.在此基础上,论述了原生质体制备技术在微藻中的应用研究进展,展望了该技术的应用前景.

摘要： 通过原生质体诱变,筛选得到阿卡波糖高产菌株,并利用原生质体制备技术解决菌种难以纯化,容易衰退的问题.实验用溶菌酶破壁的方法制备原生质体,并对影响原生质体制备的关键因素进行了研究,最终确定原生质体制备条件:一级菌丝培养时间为44～48 h,二级培养添加甘氨酸质量分数为0.3％,培养时间为40～44 h;溶菌酶质量浓度为3 mg/mL,作用时间为2h,该条件下原生质体制备量可达1.2×105个/mL;通过对制备的原生质体进行紫外诱变,筛选获得了3株阿卡波糖高产菌株,且中试放大后仍能保持高水平的发酵能力,10 m3罐发酵水平较出发菌株分别提高了19.0％,22.2％,24.8％.

摘要： 本研究以根结线虫生防真菌交枝顶孢Acremonium implicatum为供试菌株,探究了菌龄、降解酶种类、酶解温度和时间、不同渗透压稳定剂、不同pH等因素对其原生质体制备的影响,并建立了交枝顶孢原生质体制备体系;制备的原生质体在SR培养基上再生率达到17.78％.此外,GFP遗传转化菌株的获得充分表明制备的原生质体可作为后续遗传转化材料,为进一步研究交枝顶孢对根结线虫的生防机理奠定基础.

摘要： 本研究以卵孢小奥德蘑液体培养菌丝作为实验材料,利用单因子变量法探索研究了菌丝培养时间、酶浓度、酶解时间、酶解温度、稳渗剂类型对卵孢小奥德蘑原生质体制备的影响,并对原生质体再生培养基进行选择和优化.通过荧光染色,利用激光共聚焦显微镜和流式细胞仪对原生质体的制备过程、得率和活力进行研究.结果 表明,将卵孢小奥德蘑菌丝在液体培养基中培养5d收集菌丝体,以甘露醇作为渗透压稳定剂,在溶壁酶浓度2％、30°C条件下酶解5h,获得的原生质体得率最高,达2.0×107个/mL;通过流式细胞仪分析,约57.69％的原生质体细胞为活细胞;在RM培养基中再生效果最好,再生率为(0.103+0.025)％.研究结果可以为卵孢小奥德蘑育种与食用菌原生质体制备再生提供研究基础.

摘要： 粉红聚端孢是多种植物的重要病原菌.本研究通过酶解粉红聚端孢幼嫩菌丝细胞壁获得原生质体,用PEG介导原生质体转化将携带GFP基因和博来霉素抗性基因的外源DNA随机插入粉红聚端孢基因组,共获得博来霉素抗性菌株90株,转化效率达18个/μg.选取22株转化子荧光观察,发现均可表达荧光,菌株间荧光强度不同,其中10株转化子荧光表达较强.与野生型相比,突变菌株TR45的菌落生长、产孢量和致病力等生物学特性均未改变,在不含博来霉素的培养皿中继代培养10代荧光仍能稳定表达.本研究构建的高效原生质体制备和PEG介导粉红聚端孢遗传转化方法,可用于该菌基因功能研究,绿色荧光标记菌株可用于病菌侵入、田间监测、侵染循环等发生规律研究.

摘要： 使用纤维素酶和蜗牛酶复合酶液进行处理,并用β-巯基乙醇预处理,采用甘露醇作为渗透压稳定剂,考察菌龄、酶质量浓度、酶解温度和酶解时间对解脂亚罗酵母原生质体形成和再生的影响.实验得出结论:对于原生质体形成率影响因素来说,理论的最佳形成条件为:菌龄36 h,酶质量浓度为2.5 mg/mL,酶解温度为25°C,酶解时间为8 h;对于原生质体再生率影响因素来说,理论的最佳再生条件为:菌龄48 h,酶质量浓度为2 mg/mL,酶解温度为25°C,酶解时间为8 h.而综合形成率和再生率共同影响因素顺序为:菌龄>酶质量浓度>酶解温度>酶解时间,最佳制备条件为:菌龄36 h,酶质量浓度2 mg/mL,酶解温度25°C,酶解时间8 h.

摘要： 摸索了拟康氏木霉原生质体制备和再生条件,发现菌丝培养基培养12h的菌丝,以0.7mol/L NaC1为稳渗剂,在30°C、100rpm下用25mg/ml裂解酶酶解4h为最佳,原生质体在0.7mol/L的蔗糖为稳渗剂的再生培养基A中再生率最高.

摘要： 对绿色木霉(Trichodermaviride)原生质体形成和再生条件进行了研究.结果表明,绿色木霉原生质体形成的合适条件为:pH=6.98磷酸盐缓冲液中加入8mg/mLglucanex,培养24h的菌丝,40r/min振荡条件下30°C酶解4h,原生质体产量达到4.7×107个/mg.原生质体在0.3mol/L肌醇+0.3mol/LKCl的CM培养基上再生率为14.5％.

摘要： 本发明提供了一种芥菜原生质体的提取方法及芥菜杂种原生质体的融合方法。所述提取方法包括：使用酶解液将芥菜无菌苗的真叶酶解；所述酶解液由酶液与SCW液组成，所述酶液包括纤维素酶、果胶酶、甘露醇和CaCl2，pH为5.6；所述SCW液包括山梨醇、CaCl2和MES，所述SCW液的pH为5.8；向酶解产物中的上清液中加入W5溶液，离心取沉淀，向所述沉淀中加入含有MES的蔗糖溶液，离心取原生质体沉淀，再向其中加入W5溶液，离心取层析液，所述层析液即为含有所述芥菜原生质体的溶液。本发明克服了提取过程中原生质体量少、易破裂且提取效果不稳定的缺点，并且该方法融合效率比较高，原生质体仍能保持较高的细胞活性。

摘要： 本发明提供了一种杨树腐烂病病原菌原生质体的制备及其遗传转化的方法，属于分子植物病理学领域。原生质体的制备方法包括将杨树腐烂病菌接种到YEPD液体培养基中进行菌丝培养，然后将杨树腐烂病菌菌丝进行酶解处理，即得。且利用PEG介导的方法对制备的原生质体进行遗传转化，获得突变体。本发明方法制备原生质体效率高，酶解后的原生质体可高达10

摘要： 本发明属于丝状真菌的工程细胞的制备技术领域，具体涉及一种茶树菇原生质体的制备方法及原生质体单核体菌株的制备方法。本发明提供了一种茶树菇原生质体的制备方法，本发明制备得到的茶树菇原生质体得率高、制备时间短，将所述茶树菇原生质体悬浮液涂布于再生培养基平板上获得茶树菇原生质体单核体菌株，茶树菇原生质体单核化率高，经单核体菌株对峙培养后，获得两种原生质体单核体菌株交配型；测定茶树菇原生质体单核体菌株交配型为开展茶树菇的杂交育种、融合育种、诱变育种、遗传转化和功能基因挖掘等奠定基础。

摘要： 本发明公开了一种制备异叶水蓑衣原生质体的酶解液、异叶水蓑衣原生质体的制备及瞬时转化方法，涉及植物生物技术领域。其中，所述酶解液包括0.5‑4％纤维素酶、0.1‑1.2％离析酶、0.2‑1.0M D‑甘露醇、10‑30mM且pH为4‑7的吗啉乙磺酸、5‑15mM CaCl2、和0.05‑0.15％BSA。采用上述酶解液制备的原生质体及原生质体瞬时转化，可运用于检测转基因的表达效果、启动子分析、转录后基因沉默、抑制子功能鉴定、亚细胞定位、基因相互作用等，通常在瞬时表达载体上插入可以在特定荧光下观察的蛋白质的基因，方便目的基因的识别，多用于快速、高效的检测方法。

摘要： 本发明公开了一种食用菌原生质体的制备方法以及原生质体，涉及丝状真菌的工程细胞的制备技术领域。本发明提供的食用菌原生质体的制备方法包括：将食用菌菌种接种于含固体培养基的容器中进行菌丝培养，得到长有菌丝的菌落；将菌落进行细胞壁酶解，得到原生质体粗溶液；以及原生质体粗溶液经过滤、离心以及重悬后得到原生质体溶液。本发明提供的制备方法可快速获得大量原生质体。与现有的常规方法相比，本发明提供食用菌原生质体的制备方法速度有很大提高，并且步骤简单，操作更方便。

摘要： 本发明公开了一种花椒原生质体培养再生植株的方法，将来源于花椒无菌试管苗叶片的原生质体悬浮于原生质体培养基中，调整密度后经液体浅层静置培养形成细胞团和小愈伤组织；愈伤组织经增殖培养后，接种到分化培养基上培养分化出不定芽，再转接到生根培养基上培养形成完整植株。本发明对花椒原生质体培养过程中的重要环节进行了深入的研究，尤其是摸索出了专用的原生质体培养基，大大提高了原生质体的细胞分裂频率以及细胞团形成频率。本发明成功获得了原生质体再生植株，初步建立了完整的花椒原生质体再生体系，对开展花椒体细胞杂交育种、原生质体遗传转化等相关生物技术研究具有重要意义。

摘要： 本发明提供一种葡萄藻原生质体的制备方法及其制备率的检测方法。其中，葡萄藻原生质体制备方法包括如下步骤：1)选取培养至对数中期的单细胞态的葡萄藻UTEX2629培养液，离心收集藻细胞，用蒸馏水进行清洗，获得葡萄藻样品；2)向步骤1)获得的葡萄藻样品中加入高渗复合酶溶液，在黑暗条件下进行酶解，酶解温度为25°C，时间为10～14h，所述的复合高渗酶溶液含有0.6～0.7％(w/v)纤维素酶、0.6～0.7％(w/v)果胶酶、1.3～1.4％(w/v)离析酶、和0.8mol/L的KCl；3)酶解结束后，离心收集沉淀。本发明提供的葡萄藻原生质体制备方法，可有效提高葡萄藻原生质体的制备率，而且该本发明的制备方法操作简便。所提供的制备率检测方法可快速简便且准确的测定上述方法制备葡萄藻原生质体的制备率。

摘要： 本发明公开了一种高粱原生质体的制备方法及制备的原生质体的转化方法，包括以下步骤：(1)取高粱种子于水中催芽，并将芽播种、培育成黄化苗；(2)剪取生长良好的高粱黄化苗，用甘露醇预处理后，取中间的叶鞘部分，用刀片切成细条；(3)对切好的叶鞘用原生质体酶解液进行酶解处理，裂解高粱原生质体；(4)对裂解的高粱原生质体进行固液分离，即得高粱原生质体；本发明首次建立了高粱原生质体制备及转化体系，其方法简单、有效，可以用于高粱蛋白亚细胞定位，高粱蛋白互作和蛋白纯化以及荧光素酶标记的基因表达等方面的研究。

摘要： 本发明属于原生质体制备技术领域，具体涉及猕猴桃原生质体提取液和猕猴桃原生质体及其制备方法和应用。每升本发明所述猕猴桃原生质体提取液中，包括1.3％～2％W/V混合酶液，300～900mM甘露醇，50～65mM CaCl2，1～2mMDTT和10～20mM MES；所述混合酶液包括纤维素酶R‑10和果胶酶Y‑23。利用本发明猕猴桃原生质体提取液对猕猴桃果肉进行酶解，能够缩短酶解时间，使制备的原生质体保持长时间的活力，增大提取效率。

摘要： 本发明属于农业生物技术领域，具体涉及小麦原生质体的制备方法及小麦原生质体介导的转化方法。本发明的小麦原生质体制备方法包括以下步骤：培养小麦种子；剪取三叶期的小麦苗叶片，利用酶解液酶解；固液分离，得到小麦原生质体。本发明建立了小麦原生质体制备及转化体系，方法简单、有效，可以用于小麦蛋白亚细胞定位，小麦蛋白互作和蛋白纯化以及荧光素酶标记的基因表达等方面的研究。