农杆菌转化

摘要： 本文从农杆菌Ti质粒的介绍、重组质粒导入农杆菌的方法、农杆菌侵染植物细胞机理和转化法的影响因素4个角度,深入解读了近几年浙江选考题中涉及的农杆菌转化法.

摘要： 优化了农杆菌介导转化黑曲霉的方法,优化条件包括共培养材料、农杆菌种类、诱导剂浓度、共培养时间、共培养温度以及共培养时农杆菌的菌体浓度.结果 表明,农杆菌介导转化黑曲霉的最适条件为107个/mL不萌发的新鲜孢子与OD600培养至0.9～1.0的农杆菌以1:1的比例混合后,在乙酰丁香酮浓度为200 μmol/L的IM平板上,23°C避光培养48 h后进行转膜,转化子个数可达到(60±5)个转化子/106个孢子,且阳性率达到90％以上.并且构建了同源黑曲霉脂肪酶的组成型和诱导型启动子表达载体,通过优化后的农杆菌介导转化方法转化至黑曲霉中,利用罗丹明橄榄油平板对产酶转化子进行筛选鉴定,并获得了阳性克隆.

摘要： 将褐腐菌Postia placenta单核体菌株SB-12的菌丝与带有双元载体的两种农杆菌菌株LBA4404和EHA105共培养,并评估双元载体上驱动抗性基因表达的不同启动子的影响,完成了转化体系的构建和优化.结果表明:两种共培养方法中用6d菌龄的菌丝形成的菌丝垫能够被农杆菌有效转化获得转化子.无论采用哪种双元载体,EHA105菌株都比LBA4404更有效地转化菌丝体.用来自受体菌三磷酸甘油醛脱氢酶基因的启动子获得了比其他两种启动子(CaMV35S和trpC)更高的转化效率.这是国际上首次报道该菌株转化体系的构建,为对该菌株进行遗传操作打下了基础.

摘要： 从中蔬四号番茄品种中克隆能在番茄叶片中高效转录的SlU3启动子,为今后利用CRISPR/Cas9基因编辑技术进行分子育种奠定了基础.采用2轮PCR的方法,第1轮PCR从中蔬四号番茄品种中克隆了3种SlU3启动子,再采用Transfer PCR方法分别对3个启动子进行截短,共得到6个不同长度的启动子,并分别构建6个截短的SlU3启动子驱动GUS融合植物表达载体,利用农杆菌转化法分别转染番茄叶片.运用DNAMAN软件对已克隆的SlU3和拟南芥AtU3启动子序列具有转录功能的必要元件进行序列分析;经过2轮PCR,首先从中蔬四号番茄品种中克隆了3种SlU3-1P、SlU3-3P、SlU3-4P启动子,其长度分别是1156,1114,1147 bp,再采用Transfer PCR方法分别对3个启动子进行截短,共得到6个不同长度的启动子,其长度依次是489,318,450,248,457,248 bp,并分别构建6个截短SlU3启动子驱动GUS融合植物表达载体,启动子序列比对分析发现,番茄U3启动子与拟南芥U3启动子一样,也含有比较保守的2个元件,USE和TATA框,2个元件之间的位置比较固定.利用农杆菌转化法分别转染番茄叶片,结果显示,成功侵染后的番茄叶片均被染成蓝色,表明已克隆的6种不同截短番茄SlU3启动子均具有转录活性.成功克隆了6种在番茄叶片中高效转录的SlU3启动子,为构建番茄CRISPR/Cas9基因编辑载体提供更多高效的内源启动子.

摘要： DREB2As是一类可以激活干旱响应基因表达的转录因子.为了提高花生的耐旱性,本研究通过农杆菌介导的转化方式将AlDREB2A转录因子基因导入花生中.同时对影响花生转化的3种因素(烟草提取物添加量、超声波处理时间、抗生素浓度)进行优化.在聚乙二醇的干旱胁迫压力之下,AlDREB2A转基因花生的叶片相对含水量和脯氨酸含量均明显高于非转基因花生,而丙二醛含量低于非转基因花生.在表型方面,转基因花生的萎蔫程度也低于非转基因花生.研究证实,转基因花生比非转基因花生有更高的耐旱性.

摘要： 蝴蝶兰花器官中基因功能的研究受遗传转化效率低和遗传转化周期长的制约,而花瓣瞬时表达体系是一种快速分析基因功能的有效手段.该研究以蝴蝶兰'大辣椒'花瓣和萼片为实验材料,通过农杆菌介导的瞬时转化方法,分析了侵染的菌液浓度、侵染时间、乙酰丁香酮浓度和共培养时间等4个因素对β-葡糖醛酸酶(GUS)报告基因表达效率的影响,以探寻其瞬时表达的最佳条件;并将查尔酮合成酶( chalcone synthase ,CHS )基因RNAi干扰载体瞬时转化蝴蝶兰花瓣,共培养3 d后观察转化材料中花色表型以及色素的变化,并利用半定量 RT-PCR来检测C H S基因转录水平的表达.结果表明:(1 )农杆菌菌液 OD600为0 .6 、侵染时间60 s ,在重悬液中添加150 μmol/L乙酰丁香酮,共培养3 d ,GUS瞬时表达率最高(85 .01%) . (2)转基因蝴蝶兰花瓣颜色明显变淡,色素含量降低. (3)半定量PCR检测表明,C H S基因的转录活性相比于对照组显著降低.该实验成功的在蝴蝶兰花器官中建立了一种快速基因功能验证方法,为后期蝴蝶兰基因功能研究和育种工作提供技术支持.%The study of gene function in Phalaenopsis aphrodite is hampered by the low efficiency of trans-formation systems and the long time span needed for the generation of transgenic plants.Therefore ,the es-tablishment of transient expression system of Phalaenopsis aphrodite petals will be an effective method for gene function analysis.An experiment was conducted to investigate the transient expression mediated by Agrobacterium tumefaciens using the sepals and petals of Phalaenopsis aphrodite (P.'Big chili'). Effects of A.tume faciens concentration ,infection time ,acetosyringone concentration ,and co-culture length on the transient expression of β-glucuronidase(GUS)gene were analyzed to determine the optimal transfor-mation condition.The chalcone synthetase gene RNAi interference vector was transiently transformed into the petals of Phalaenopsis aphrodite.After 3 days of co-cultivation ,changes in the phenotype and pig-mentation of the flower color were observed ,and RT-PCR was used to detect the expression level of CHS gene transcription.(1)A higher transient expression level of GUS gene could be obtained as OD600 value of A.tume faciens 0.6 ,infiltrating for 60 seconds ,adding 150 μmol/L acetosyringone to co-culture medium , and co-culture for 3 days in darkness.It reaches 85.01%.(2)The color of the petals of transgenic Phalae-nopsis aphrodite was significantly lighter and pigment content decreased.(3 ) Semi-quantitative PCR showed that the transcriptional activity of CHS gene was significantly lower than that of the control group.The experiment successfully established a rapid gene function verification method ,providing techni-cal support for the study of gene function and breeding work of the Phalaenopsis aphrodite.

摘要： 农杆菌与受体的共培养条件,对农杆菌介导的遗传转化有着重要的作用,为了提高玉米芽生长点的遗传转化效率,以郑58玉米自交系的种子为试验材料,用EGFP(增强型绿色荧光蛋白)基因作为标记基因,通过控制农杆菌共培养时的水分提供方式,研究共培养时的水分条件对农杆菌转化玉米芽生长点的影响.结果表明,将转化的玉米种子放到加有2层滤纸的培养皿中,每培养皿放置10～15粒种子,加1.5 mL无菌水,放在25°C暗培养3～4 d,在不影响转化效果的基础上有利于转化后发芽,可获得较多的转化材料.

摘要： Using Agrobacterium transformation method,the epicotyl explants of cotton Liao19 were transformed with Aeluropus vacuolar Na+/H+ antiporter gene AlNHX1 to improve its salt resistance.We have established and optimized a transformation system was established and optimized to study several important factors on cotton transformation.The results showed that:1) The optimum Agrobacterium infection time was 90 s.In the co-culture medium,the optimum concentration of AS was 100 mg/L.The hygromycin optimal concentration of the cotton filter medium was 30 mg/L.The IBA optimal concentration of rooting medium was 10 mg/L;2) For all the transformation cottons,PCR test results showed that the salt tolerance gene AlNHX1 was successfully transformed into cotton Liao19;3) Physiological studies showed that the relative conductivity and osmotic potential of transgenic plants were all significantly lower than non-transgenic ones under the salt stress.This study confirmed that the cotton Liao19 obtained certain salt resistance by screening and optimizing the transformation system and provided reference for the cultivation of cotton in coastal beach area.%为提高辽宁棉花品种的耐盐性,利用农杆菌介导上胚轴外植体转化法,将来源于盐生植物獐茅的Na+/H+逆向转运蛋白基因(AlNHX1)导入棉花辽棉19号中,分析影响棉花上胚轴外植体农杆菌转化的几个重要因素,建立并优化了该品种的转化体系,结果表明:1)农杆菌侵染的最佳时间为90 s,共培养过程中乙酰丁香酮最适浓度为100 mg/L,筛选培养基中潮霉素最适浓度为30 mg/L,生根培养基中吲哚乙酸IBA的最适浓度为10 mg/L;2)对转化植株进行PCR检测,表明耐盐基因AlNHX1已导入辽棉19号中;3)在盐胁迫下,转基因植株的电导率,渗透势都显著低于未转化植株.结果表明,通过筛选并优化转化体系,辽棉19号品种的耐盐性有较明显的提升,为沿海滩涂地区种植棉花提供了一定的参考.

摘要： 由尖孢镰刀菌甘薯专化型Fusarium oxysporum f.sp.batatas引起的甘薯蔓割病是甘薯生产上一种重要病害.本研究将带有GFP绿色荧光蛋白基因的T□DNA随机插入到蔓割病菌基因组中,获得711个突变体.经过致病力筛选,获得了3株非致病突变体,编号为50□5,55□7和103□4,其中50□5和103□4产孢能力显著下降.平板对峙试验结果表明这3株非致病突变体均可和蔓割病菌发生营养竞争作用.通过提前对感病品种“新种花”接种非致病突变体,再接种蔓割病菌,结果显示当蔓割病菌和非致病突变体孢子浓度同为5×105CFU/mL时,103□4和55□7分别预处理感病品种8h后,生防效果趋于稳定,分别为86.95％和83.80％;50□5预处理16h后生防效果趋于稳定,为75.65％.以上结果表明,通过农杆菌转化筛选非致病突变体的方法,成功获得3株蔓割病生防菌株,为深入开展甘薯蔓割病的生物防治提供基础,也为其他尖孢镰刀菌创造非致病生防菌提供借鉴.

摘要： 胡萝卡进行农杆菌转化时,胚状体发生的激素条件研究表明,对于"新透心红"品种来说,各激素组合中,在0.1mg/L 2,4-D的培养基上诱导出的胚性愈伤块的胚状体发生的频率最高为98﹪;随着KT的浓度升高,胚状体的发生频率下降."AC93"的再生培养基途径为:在B+0.2 mg/L2,4-D诱导性愈伤组织块的胚状体发生频率最高,而且能形成健康小植株.

摘要： 肉桂酸4-羟基化酶(cinnamate-4-hydroxylase，C4H)和4-香豆酸辅酶A连接酶(4-hydroxycinnamate CoA ligase，4CL)是木质素合成中苯丙烷途径所涉及的2种酶，催化苯丙氨酸到羟基肉桂酸及其辅酶A酯类的过程。本研究通过构建水稻C4H、4CL基因的RNAi表达载体，利用农杆菌介导的方法转化水稻品种“中花11”，获得了单基因C4H、4CL和C4HL双基因RNAi转基因株，对T0代转基因水稻成熟植株秸秆木质素含量测定表明，转基因植株木质素含量较非转基因植株均有降低。对T1代半定量RT-PCR检测表明阳性转基因株中C4H、4CL基因的表达量明显低于对照。综合转基因株田间生长农艺性状，获得木质素含量降低且不影响植株农艺性状转基因株C4H，为水稻秸秆的综合利用提供了借鉴。

摘要： 肉桂酸4-羟基化酶(cinnamate-4-hydroxylase，C4H)和4-香豆酸辅酶A连接酶(4-hydroxycinnamate CoA ligase，4CL)是木质素合成中苯丙烷途径所涉及的2种酶，催化苯丙氨酸到羟基肉桂酸及其辅酶A酯类的过程。本研究通过构建水稻C4H、4CL基因的RNAi表达载体，利用农杆菌介导的方法转化水稻品种“中花11”，获得了单基因C4H、4CL和C4HL双基因RNAi转基因株，对T0代转基因水稻成熟植株秸秆木质素含量测定表明，转基因植株木质素含量较非转基因植株均有降低。对T1代半定量RT-PCR检测表明阳性转基因株中C4H、4CL基因的表达量明显低于对照。综合转基因株田间生长农艺性状，获得木质素含量降低且不影响植株农艺性状转基因株C4H，为水稻秸秆的综合利用提供了借鉴。

摘要： 肉桂酸4-羟基化酶(cinnamate-4-hydroxylase，C4H)和4-香豆酸辅酶A连接酶(4-hydroxycinnamate CoA ligase，4CL)是木质素合成中苯丙烷途径所涉及的2种酶，催化苯丙氨酸到羟基肉桂酸及其辅酶A酯类的过程。本研究通过构建水稻C4H、4CL基因的RNAi表达载体，利用农杆菌介导的方法转化水稻品种“中花11”，获得了单基因C4H、4CL和C4HL双基因RNAi转基因株，对T0代转基因水稻成熟植株秸秆木质素含量测定表明，转基因植株木质素含量较非转基因植株均有降低。对T1代半定量RT-PCR检测表明阳性转基因株中C4H、4CL基因的表达量明显低于对照。综合转基因株田间生长农艺性状，获得木质素含量降低且不影响植株农艺性状转基因株C4H，为水稻秸秆的综合利用提供了借鉴。

摘要： 肉桂酸4-羟基化酶(cinnamate-4-hydroxylase，C4H)和4-香豆酸辅酶A连接酶(4-hydroxycinnamate CoA ligase，4CL)是木质素合成中苯丙烷途径所涉及的2种酶，催化苯丙氨酸到羟基肉桂酸及其辅酶A酯类的过程。本研究通过构建水稻C4H、4CL基因的RNAi表达载体，利用农杆菌介导的方法转化水稻品种“中花11”，获得了单基因C4H、4CL和C4HL双基因RNAi转基因株，对T0代转基因水稻成熟植株秸秆木质素含量测定表明，转基因植株木质素含量较非转基因植株均有降低。对T1代半定量RT-PCR检测表明阳性转基因株中C4H、4CL基因的表达量明显低于对照。综合转基因株田间生长农艺性状，获得木质素含量降低且不影响植株农艺性状转基因株C4H，为水稻秸秆的综合利用提供了借鉴。

摘要： 肉桂酸4-羟基化酶(cinnamate-4-hydroxylase，C4H)和4-香豆酸辅酶A连接酶(4-hydroxycinnamate CoA ligase，4CL)是木质素合成中苯丙烷途径所涉及的2种酶，催化苯丙氨酸到羟基肉桂酸及其辅酶A酯类的过程。本研究通过构建水稻C4H、4CL基因的RNAi表达载体，利用农杆菌介导的方法转化水稻品种“中花11”，获得了单基因C4H、4CL和C4HL双基因RNAi转基因株，对T0代转基因水稻成熟植株秸秆木质素含量测定表明，转基因植株木质素含量较非转基因植株均有降低。对T1代半定量RT-PCR检测表明阳性转基因株中C4H、4CL基因的表达量明显低于对照。综合转基因株田间生长农艺性状，获得木质素含量降低且不影响植株农艺性状转基因株C4H，为水稻秸秆的综合利用提供了借鉴。

摘要： 利用农杆菌介导的方法，将抑制植物衰老基因pCAMBIA1301-SAG12-ipt导入甘蓝型油菜恢复系XF-525和XF-263，获得了抗卡那霉素的再生植株，经过PCR初步鉴定，目的基因已经整合到NEAR基因组中。对遗传转化影响因素的研究表明：经预培养2d后进行农杆菌侵染的下胚轴抗性绿芽率高于对照；农杆菌侵染后的下胚轴经过恢复培养一周再进行筛选培养有利于抗性绿芽的诱导；农杆菌侵染以直接将菌液与油菜下胚轴共培养2～3d后进行筛选培养的抗性绿芽率较高。

摘要： 利用农杆菌介导的方法，将抑制植物衰老基因pCAMBIA1301-SAG12-ipt导入甘蓝型油菜恢复系XF-525和XF-263，获得了抗卡那霉素的再生植株，经过PCR初步鉴定，目的基因已经整合到NEAR基因组中。对遗传转化影响因素的研究表明：经预培养2d后进行农杆菌侵染的下胚轴抗性绿芽率高于对照；农杆菌侵染后的下胚轴经过恢复培养一周再进行筛选培养有利于抗性绿芽的诱导；农杆菌侵染以直接将菌液与油菜下胚轴共培养2～3d后进行筛选培养的抗性绿芽率较高。

摘要： 利用农杆菌介导的方法，将抑制植物衰老基因pCAMBIA1301-SAG12-ipt导入甘蓝型油菜恢复系XF-525和XF-263，获得了抗卡那霉素的再生植株，经过PCR初步鉴定，目的基因已经整合到NEAR基因组中。对遗传转化影响因素的研究表明：经预培养2d后进行农杆菌侵染的下胚轴抗性绿芽率高于对照；农杆菌侵染后的下胚轴经过恢复培养一周再进行筛选培养有利于抗性绿芽的诱导；农杆菌侵染以直接将菌液与油菜下胚轴共培养2～3d后进行筛选培养的抗性绿芽率较高。

摘要： 本发明公开了一种发根农杆菌介导的下胚轴涂抹转化方法在大豆转化方面的应用。本发明首次将发根农杆菌介导的下胚轴涂抹转化方法应用于大豆，成功地进行了大豆根部毛状根转化。本发明对种子萌发时间、筛选剂浓度进行优化，不仅能够增加每个大豆外植体诱导出的转基因毛状根数量，而且能够显著提高毛状根的转化频率和生长状态，在无菌条件下成功地利用大豆转化常用的筛选标记除草剂获得大豆“复合植株”，其既有转基因的根部，又有非转基因的地上部，是在无菌组织培养条件下研究与根系形态、根部共生固氮和菌根形成有关的基因的理想材料。

摘要： 本发明公开了一种建立农杆菌介导东农冬麦1号成熟胚遗传转化的方法，包括：挑选当年籽粒饱满的东农冬麦1号成熟种子，消毒，灭菌，清洗，无菌干燥后取胚，接种在诱导培养基中培养，再置于预培养培养基中进行预培养得到预培养愈伤组织；取农杆菌在YEP培养基划线培养；接着挑取培养得到的农杆菌单菌落接种在液体YEB培养基中培养至对数期，离心得到菌液；将菌液加入侵染培养基中重悬得到混合物料；将预培养愈伤组织浸入混合物料中侵染，无菌干燥，置于含有两层无菌滤纸的培养皿中进行共培养；再置于恢复培养基上进行恢复培养；接着置于分化筛选培养基上进行抗性筛选；再置于生根培养基中进行壮苗生根培养，炼苗，然后将植株移栽到花盆中培养。

摘要： 本发明公开了一种利用潮霉素抗性基因

摘要： 本发明公开了一种发根农杆菌介导的下胚轴涂抹转化方法在大豆转化方面的应用。本发明首次将发根农杆菌介导的下胚轴涂抹转化方法应用于大豆，成功地进行了大豆根部毛状根转化。本发明对种子萌发时间、筛选剂浓度进行优化，不仅能够增加每个大豆外植体诱导出的转基因毛状根数量，而且能够显著提高毛状根的转化频率和生长状态，在无菌条件下成功地利用大豆转化常用的筛选标记除草剂获得大豆“复合植株”，其既有转基因的根部，又有非转基因的地上部，是在无菌组织培养条件下研究与根系形态、根部共生固氮和菌根形成有关的基因的理想材料。

摘要： 本发明涉及一种农杆菌介导的植物无选择基因转化方法，步骤为：构建适用于农杆菌介导的基因转化载体；使用缩小的外植体，这类外植体或外植体的受侵染截面含有1－20个可再生细胞；外植体被通过预处理或预培养，以减少由于农杆菌的作用引起的受侵染细胞的死亡；将这类外植体与农杆菌在营养缺失的条件下共培养；使用抗生素抑制农杆菌的生长；在不含有选择试剂的培养基中诱导外植体愈伤组织；在不含有选择试剂的分化培养基中获得再生植株；通过分子生物学或化学分析鉴定转基因植株；转基因植株在所有再生植株中所占的比例高于20％。

摘要： 本发明涉及一种玉米农杆菌转化受体的制备方法及农杆菌介导的玉米转化方法，属于玉米生物技术育种技术领域。本发明提供的玉米农杆菌转化受体的制备方法，包括以下步骤：1)将玉米幼胚进行诱导培养，得到疏松的II型愈伤组织；2)将步骤1)得到的疏松的II型愈伤组织进行酶解，得到感受态II型愈伤组织细胞，即玉米农杆菌转化受体；所述酶解用酶包括纤维素酶和果胶酶。本发明提供的转化受体选用感受态玉米II型愈伤组织，克服了玉米幼胚来源的季节限制，为建立稳定的玉米农杆菌转基因体系奠定了基础。

摘要： 本发明公开了菠萝农杆菌转化受体的制备方法及其在菠萝转化中的应用，制备方法包括：取菠萝植株作为外植体，将菠萝植株消毒处理后，通过不定芽诱导培养基诱导不定芽的产生，使不定芽产生的过程中，菠萝植株的基部产生组织块，然后取组织块，将其切成小块后，置于菠萝愈伤组织诱导培养基中，制得菠萝愈伤组织，即菠萝农杆菌转化受体；该方法与传统菠萝愈伤组织诱导和转化相比，通过优化外植体消毒方法得到无菌植株，并在组织块的基础上诱导菠萝愈伤组织，缩短了菠萝愈伤组织诱导时间，并且诱导得到的菠萝愈伤组织状态较好，利于转化，提高了菠萝的转化效率。本发明所述方法所需设备简单、操作技术容易掌握，具有广阔的开发应用前景。

摘要： 本发明提供了一种番木瓜愈伤组织农杆菌转化受体的制备方法，其特征在于：将番木瓜种子消毒后，先后浸泡于NaClO溶液和KNO3溶液中，再转移到含有抗生素的无菌水中萌发长芽，待芽长出后移植到琼脂培养基中黑暗培养至长苗，将苗的下胚轴切下进行愈伤组织诱导，待胚性愈伤长出后扩繁四到五次，即所述的番木瓜愈伤组织农杆菌转化受体。该方法与传统番木瓜愈伤组织转化相比，通过改良愈伤组织的诱导培养基，愈伤诱导时间显著缩短，并且愈伤状态好利于转化，番木瓜转化效率高。本发明所述方法所需设备简单、操作技术容易掌握，具有广阔的开发应用前景。

摘要： 本发明提供了一种番木瓜下胚轴农杆菌转化受体的制备及转化方法，将番木瓜种子消毒后，先后浸泡于NaClO溶液和KNO3溶液中，再转移到含有抗生素的无菌水中萌发长芽，待芽长出后移植到琼脂培养基中黑暗培养至长苗，后，再在优化培养基M13上诱导外植体长愈伤，即得所述的番木瓜下胚轴农杆菌转化受体。该转化方法与传统番木瓜转化相比，直接使用预培养的下胚轴作为外植体，避免了愈伤诱导后扩繁的4‑5个月时间，显著缩短转化周期。本发明所述方法所需设备简单、操作技术容易掌握，具有广阔的开发应用前景。

摘要： 本发明属生物技术领域，涉及一种金刚砂辅助农杆菌转化狗尾草种子的高效转化方法，包括外植体的处理和活化、金刚砂创伤处理及农杆菌浸染、共培养、抑菌和筛选培养、抗性愈伤成苗培养、生根培养等过程。本发明步骤简单，易操作，以成熟的狗尾草种子为外植体，种子经发芽活化处理后，用金刚砂辅助造成伤口，进行农杆菌转化，大大提高了狗尾草的转化效率，缩短了转化周期，简化了转化程序，扩大了转化品系的范围，为狗尾草建立了一种灵活、周期短、高效的转基因技术体系。