兔出血症病毒

摘要： 兔出血症病毒(RHDV)是兔出血症的病原体,可导致成年兔大量死亡.研究表明,细胞因子在RHD致病中发挥了重要作用.为探索细胞因子在RHDV对幼兔和成年兔致病差异性中的作用机制,通过对幼兔(2周龄)和成年兔(3月龄)肌肉注射检测为RHDV核酸阳性的病兔肝脏悬液,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测感染RHDV后不同时间(0、12、24、36、48、60 h)血清中IL-8、IL-10、TNF-α、TGF-β和MCP-1的水平.ELISA结果显示,成年兔感染RHDV后血清中IL-8、IL-10、TNF-α、TGF-β和MCP-1水平在0~36 h显著升高(P<0.05),并在感染后36~48 h死亡.幼兔感染后血清中IL-8水平在24~60 h明显上升(P<0.05),TNF-α和TGF-β水平变化无明显规律,IL-10和MCP-1水平无明显变化,且未出现死亡现象.比较幼兔和成年兔上述细胞因子水平发现,成年兔感染后血清中IL-8、IL-10、TGF-β和MCP-1水平显著高于幼兔(P<0.05),TNF-α水平在感染后24 h左右高于幼兔(P<0.001),其余时间均低于幼兔(P<0.01).研究结果提示,IL-8、IL-10、TNF-α、TGF-β和MCP-1在血清中的水平差异可能是影响RHDV对幼兔与成年兔致病差异的关键因素.

摘要： 为研究兔出血症病毒(RHDV)VP60蛋白形成的病毒样颗粒联合多杀性巴氏杆菌(Pm)、产气荚膜梭菌(Cp)的免疫效果,将3种抗原与铝胶佐剂混合制成三联灭活疫苗,进行安全检验、最小免疫剂量测定及免疫持续期研究.结果表明,3批疫苗以4.0 mL/只免疫兔未见任何不良反应;对兔的最小免疫剂量为1.0 mL/只,免疫后14日,血清RHDV HI效价为1:16～1:64,攻毒后免疫兔均健活(5/5);免疫后21 d,用Pm和Cp分别攻毒,免疫兔80％以上(4/5～5/5)保护;免疫持续期可达210 d.RHDV VP60蛋白形成的病毒样颗粒可与Pm、Cp联合制备疫苗,解决了传统RHDV组织灭活苗生产过程存在的生物安全风险问题,同时实现了一针三防.

摘要： 为建立一种敏感、特异、快速、操作简便、易于判定的鉴别检测兔出血症病毒(RHDV)与兔出血症病毒2型(RHDV2)荧光定量RT-PCR检测方法,本研究选择RHDV与RHDV2 VP60基因序列高度同源的保守区域设计了 3对引物,经荧光定量PCR扩增比较,筛选出1对引物,对各反应条件进行优化,建立了 RHDV与RHDV2荧光定量PCR检测方法,且基于RHDV较RHDV2扩增产物熔解曲线Tm值高1.57°C～2.74°C,能够达到鉴别检测的目的.特异性试验显示,该方法仅对RHDV和RHDV2检测为阳性,对猪瘟兔化弱毒、兔多杀性巴氏杆菌、A型魏氏梭菌、波氏杆菌检测均为阴性,特异性强.敏感性试验显示,该方法对RHDV与RHDV2VP60基因重组质粒标准品的最低检测限均为1×101拷贝/μL,敏感性高;重复性试验显示,RHDV VP60基因质粒标准品批内和批间Cp值最大变异系数分别为1.91、3.60,Tm值最大变异系数分别小于0.72、0.48;RHDV2 VP60基因质粒标准品批内和批间Cp值最大变异系数分别为1.90、3.93,Tm值最大变异系数分别为0.29、0.17,均小于5％,重复性好.采集RHDV AV34株感染病死兔的肝脏、肺脏、脾脏、肾脏、心肌组织、内皮组织、口鼻粘液、肌肉组织、肛门排泄物、尿液等组织样品,进行病毒组织分布与排毒的检测,结果显示,各组织样品均为阳性,表明病毒在体内分布广泛,病毒可通过口鼻分泌物及粪尿排泄物排出.利用该方法检测临床肝组织样品,结果显示,RHDV AV34标准株阳性肝组织与14份RHDV临床肝组织样品、RHDV2分离株SC2020/04感染样品均为阳性,而常规RT-PCR方法对其中1份RHDV临床肝组织样品检测为阴性,两种方法符合率为93.3％.本研究建立了一种能够鉴别检测RHDV与RHDV2的荧光定量RT-PCR方法,为开展兔病毒性出血症的临床诊断、流行病学调查与防控等提供了有效的技术保障.

摘要： 为提高兔出血症病毒衣壳蛋白VP60在Bac-to-Bac系统的表达量,本研究使用Hr1、Hr3、WPRE、SV40、CAG、Melt等顺式作用元件及元件组合对pFastBacDual供体质粒进行改造,将改造后的供体质粒用于重组VP60蛋白的表达.通过重组杆状病毒滴度测定、IFA、SDS-PAGE、Western blot、血凝效价测定等方法对重组VP60蛋白的产量、反应原性进行评价.结果表明,所有重组VP60蛋白均能够与VP60单克隆抗体反应,具有良好的反应原性,Hr1、Hr3、SV40、Hr1-WPRE、Hr3-WPRE、SV40-WPRE、SV40-WPRE-Melt能够提高重组VP60蛋白产量,其中Hr3、SV40-WPRE改造类型的提升作用更为显著,研究结果为降低兔出血症病毒亚单位疫苗生产成本提供参考,对其他重组蛋白在Bac-to-Bac系统中的表达量提升具有一定的借鉴意义.

摘要： 兔出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)及兔粘液瘤病毒(Myxoma virus,MYXV)分别引起兔出血症(兔瘟)和兔粘液瘤病,是两种严重危害家兔养殖业以及导致原产地欧洲野兔-穴兔(Oryctolagus cuniculus)种群近濒危的重要病原.VP60为构成RHDV衣壳的主要抗原蛋白.为研制能同时免疫预防该两种疫病的重组二联疫苗,本研究分别以MYXV和其复制非必需基因——胸腺激酶(Thymidine kinase,TK)基因为重组载体和同源重组靶基因,构建穿梭载体p7.5-VP60-GFP.将p7.5-VP60-GFP载体转染被MYXV感染的兔肾细胞株RK13,经同源重组后,在荧光显微镜下筛选出表达GFP的重组病毒,并将其命名为rMV-VP60-GFP.通过PCR和Western blotting进行重组病毒vp60基因特异性插入和表达验证结果显示,vp60和gfp基因成功插入MYXV基因组中并且可成功表达,表明成功构建了表达RHDV衣壳蛋白基因vp60的重组MYXV.动物攻毒保护试验表明,制备的重组病毒能保护家兔抵抗MYXV的致死性攻击,这为后续疫苗的研发奠定了基础.

摘要： 本文通过病料采集和处理,排除细菌感染、进行动物攻毒试验与病毒传代,自锦州市某兔场发病死亡动物肝脏组织样品中分离病原并通过血凝-血凝抑制(HA-HI)试验、琼脂扩散试验、电镜检测、RT-PCR方法鉴定为兔出血症病毒(RHDV).结果表明,将该病毒连续4代接种兔体,实验兔所表现出的临床症状和病理变化与兔出血症均一致,这将为兔出血症流行病学调查、新型重组疫苗与诊断试剂的研制奠定基础.

摘要： 兔出血症是由兔出血症病毒引起的一种发病率高、致死率高的烈性传染病,以肝坏死和肺出血为典型组织病变.兔出血症病毒VP60蛋白是该病毒主要的结构蛋白和免疫原性蛋白,能够诱导机体发生免疫应答,产生保护性抗体,因此关于该蛋白的结构、表达及功能是研究该病毒的一个重要内容.本文综述了国内学者近几年关于VP60蛋白的基因、表达和变异研究进展情况,希望能为兔出血症病毒研究提供参考.

摘要： 为制备兔出血症病毒VP60单克隆抗体,利用HEK 293T细胞瞬时表达VP60,免疫Balb/c小鼠,将小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,间接ELISA筛选获得阳性克隆细胞株-5D11.利用血凝抑制(HI)、间接免疫荧光(IFA)和Western blot等方法对5D11分泌的单克隆抗体活性进行鉴定,并对其识别区域进行了定位.结果显示,5D11能抑制病毒凝集人"O"型红细胞,与杆状病毒表达的VP60蛋白发生特异性抗原抗体反应,且其识别VP60蛋白线性抗原表位,并定位于494 aa-579 aa区段.成功制备了抗VP60蛋白单克隆抗体,为开展病原学检测、流行病学研究等奠定了基础.

摘要： 泰泽氏菌、肺支原体、兔出血症病毒是实验动物重要的致病病原体,可引起呼吸系统、消化系统疾病,对动物的生产和动物实验可产生不良影响.本文对上述国家检测标准规定必须检测且有检测难度的三种病原体进行方法学总结,以获得更好特异性和敏感性的诊断方法,提出传统方法初检、PCR方法复检的方法以提高检测结果的准确性和可靠性.

摘要： 为检测兔出血症病毒(RHDV)衣壳蛋白(VP60)P区形成二聚体的能力及其与HBGAs受体结合的能力,本研究以pMD19T-VP60为模板扩增包含铰链区H的P区基因(HP)并克隆至原核表达载体pET28a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导表达,获得HP蛋白.经SDS-PAGE和Western blot检测,结果显示,HP蛋白主要以包涵体的形式高效表达,经HisTrap亲和柱纯化后可形成二聚体结构.通过HBGAs受体结合试验表明,P区与完整病毒衣壳相似,能与唾液中的HBGAs受体发生结合.该研究为进一步研究RHDV衣壳蛋白与受体的相互作用奠定基础.

摘要： 目的：了解全国实验动物检测相关实验室在兔出血症病毒抗体检测项目的技术水平,发现并解决检验中存在的问题,提高检测水平.方法：不限定检测方法,结果以阳性或阴性表示,根据与预期结果的一致程度判断是否合格.结果：来自14个省市自治区的20个实验室报名参加本次比对实验,均在规定时间内反馈了检测结果,17个实验室检测结果为合格或优秀,占参加比对实验室的85％.在20个实验室中,14个实验室采用了酶联免疫吸附实验(ELISA)方法,6个实验室采用血凝抑制实验(HAI)方法.结论：全国各实验动物检测机构兔出血症病毒抗体总体检测能力较高,采用ELISA方法具有更高的灵敏度.

摘要： 在兔出血症病毒主要结构蛋白VP60的N端插入双串联OVA CD8+T细胞表位(ovalbumin,卵清蛋白第257-264位氨基酸),研究外源片段对VP60蛋白表达及病毒样颗粒(VLPs)装配的影响,分析VP60作为载体的可行性和对外源基因长度的耐受性.通过分子生物学方法将双串联OVA CD8+T细胞表位(257aa-264aa)插入至RHDV衣壳蛋白VP60基因序列的N端,得到重组VP60基因.利用杆状病毒表达系统表达嵌合蛋白,并命名为DN.经RT-PCR、间接免疫荧光、SDS-PAGE、western blot方法鉴定嵌合蛋白DN的表达,利用电镜观察嵌合蛋白病毒样颗粒的形成.结果表明嵌合VP60蛋白在杆状病毒表达系统中得到高效表达,且可形成与RHDV VLPs类似的病毒样颗粒.本研究为VP60作为载体系统,有效提呈外源片段的研究提供了重要依据,同时也为VLPs疫苗的研制奠定了基础.

摘要： 病毒识别细胞表面的受体是病毒感染的第一步,为了筛选兔出血症病毒(RHDV)的肝脏细胞表面受体,成年兔肝脏组织经胰酶消化及300目铜网过滤,得到完整的兔肝脏细胞,用生物素对细胞表面蛋白进行标记和分离;采用病毒铺覆蛋白技术(Virus overlay protein blot assay,VOPBA)分析兔肝脏细胞表面蛋白,结果表明在130 ku-170 ku的位置上存在与RHDV相互作用的特异性蛋白条带,利用液相色谱联合质谱技术(LC MS/MS)对特异蛋白条带进行shotgun分析,鉴定得到39个候选蛋白,其中3种蛋白在病毒感染过程中具有重要作用.本研究将为RHDV受体的进一步探索奠定基础.

摘要： 衣壳蛋白VP60是兔出血症病毒粒子的主要结构蛋白，是病毒免疫保护性抗原。为研发兔出血症疫苗，对兔出血症病毒主要结构蛋白VP60的编码基因的序列进行密码子优化并。利用大肠杆菌表达系统获得重组蛋白并制备了效价高且特异性好的兔源多克隆。利用家蚕杆状病毒表达系统成功表达了VP60蛋白，经检测，VP60蛋白在家蚕中含量高并可形成病毒样空衣壳粒子。动物免疫实验显示，该空衣壳疫苗可有效刺激机体产生特异性抗体，攻毒实验表明疫苗免疫后的家兔可抵抗强毒攻击，病理检测结果显示此疫苗无毒副作用。这为制备安全有效的兔出血症基因工程疫苗等研究奠定基础。

摘要： 兔出血症病毒(RHDV)的基因组仅编码两个结构蛋白，其中一种为衣壳蛋白( VP60)，另一种为次结构蛋白(VP2)。目前，对衣壳蛋白的生物学功能已基本清楚。但是，关于次结构蛋白的生物学功能还不是很清楚。为此，本研究利用反向遗传学技术结合体外表达技术，系统研究了该蛋白的生物学功能。研究结果表明，RHDV的基因组缺失次结构蛋白(VP2)后，病毒的侵染性有所降低，但是病毒基因组的复制能力和衣壳蛋白的表达水平有所提高，说明VP2不是维持RHDV侵染性所必需的蛋白。体外研究也表明，VP2的缺失并不影响病毒样颗粒的组装，提示该蛋白不是组成病毒衣壳的组成成分。通过对接种VP2的细胞进行DAPI染色和DNA片断分析研究，发现VP2具有诱导宿主细胞凋亡的功能。由此，可以推测VP2可能在RHDV的致病机制过程发挥重要作用。

摘要： 本文通过定点突变RHDV衣壳蛋白表面高度变异区,构建了含突变位点RGD的RHDV基因组全长重组质粒pRHDVRGD.然后,利用BSR细胞进行拯救.IFA、Western blot、RT-PCR和透射电子显微镜检测结果均证明成功拯救出RHDVRGD突变株.该人工构建RHDV不仅能够在RK-13细胞中稳定增殖传代,而且继承了母本毒株的生物学特性.具有良好免疫原性,为研究兔瘟病毒的致病机理、分子生物学以及研发RHDV细胞灭活疫苗奠定了基础.

摘要： 利用RT-PCR技术扩增出RHDV VP60基因中201bp的保守序列,并克隆到pMD18-T载体中作为标准品制作标准曲线,建立了RHDV的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法.该方法检测灵敏度可达6×101拷贝,与兔水疱性口炎病毒和轮状病毒均不发生交叉反应,具有良好的特异性和重复性.结果表明,建立的实时荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床RHDV的检测.

摘要： 提取感染组和对照组的兔肝脏总蛋白，采用双向凝胶电泳技术比较分析差异表达蛋白;经MALDI-TOF-TOF质谱分析，搜索蛋白质数据库，获得差异蛋白质的信息。经过初步筛选和质谱分析，共获得60个具有统计学意义的表达差异蛋白点，其中19个在感染中表达上调，41个表达下调。通过比较人工感染兔出血热病毒(RHDV)组和对照组兔肝脏整体蛋白表达谱，筛选出了5种可能在病毒整个感染过程中起作用的差异蛋白。

摘要： 本发明涉及兔病毒性出血症病毒衣壳蛋白重组杆状病毒及基因工程疫苗，属于生物制药领域。通过RT-PCR扩增兔病毒性出血症病毒衣壳蛋白VP60全基因，通过分子生物学技术构建杆状病毒重组载体，转染Sf9细胞，使VP60基因获得表达，然后以重组杆状病毒表达的兔病毒性出血症病毒衣壳蛋白VP60作为抗原，加上相应的佐剂制成兔病毒性出血症的基因工程疫苗。本发明可以提供一种免疫效果好、工艺简便的兔病毒性出血症病毒衣壳蛋白基因工程疫苗，用于预防控制兔病毒性出血症。

摘要： 本发明公开了一种同时表达兔病毒性出血症病毒经典型及二型衣壳蛋白的杆状病毒及其制备和应用，所述病毒采用以下方法制备：A、分别扩增classic RHDV和RHDV2的VP60基因；B、将步骤A得到的VP60基因分别与pEASY‑Vector连接，转化培养后得质粒；C、将步骤B得到的质粒的VP60基因克隆于昆虫杆状病毒表达载体中，转化感受态细胞，得重组穿梭质粒；D、将步骤C得到的重组穿梭质粒在脂质体介导下转染昆虫细胞，即得。采用该杆状病毒制备的预防兔病毒性出血症经典型及二型的二价亚单位疫苗可以产生高水平的VP60特异性抗体且抗体具有良好的中和病毒能力，IL‑4和IFN‑γ细胞因子水平也显著上升。

摘要： 本发明提供了一种表达兔病毒性出血症病毒Ⅱ型衣壳蛋白杆状病毒的制备及应用，所述制备方法包括以下步骤：A、扩增RHDV2的VP60基因；B、将步骤A得到的VP60基因克隆于昆虫杆状病毒表达载体中，得质粒；C、将步骤B得到的质粒转化感受态细胞，得重组质粒；D、将步骤C得到的重组质粒在脂质体介导下转染昆虫细胞，即得所述表达兔病毒性出血症病毒Ⅱ型衣壳蛋白杆状病毒。本发明成功构建了表达兔病毒性出血症Ⅱ型衣壳蛋白的杆状病毒，并使其在昆虫细胞上成功表达，最终通过蛋白电泳，免疫印迹、电镜观察进行了病毒表达产物的鉴定。该杆状病毒在未来可以用来进行新型兔病毒性出血症亚单位疫苗的研究，以此用来预防兔病毒性出血症Ⅱ型。

摘要： 本发明涉及兔病毒性出血症病毒衣壳蛋白基因重组腺病毒及疫苗，属于生物制药领域。通过RT－PCR扩增兔病毒性出血症病毒衣壳蛋白VP60全基因，通过分子生物学技术构建腺病毒重组载体，转染HEK293－A细胞，使VP60基因获得表达，然后以重组腺病毒表达的兔病毒性出血症病毒衣壳蛋白VP60作为抗原，加上相应的佐剂制成兔病毒性出血症的基因工程疫苗。本发明可以提供一种免疫效果好、工艺简便的兔病毒性出血症病毒衣壳蛋白基因工程疫苗，用于预防控制兔病毒性出血症。

摘要： 本发明涉及兔病毒性出血症病毒衣壳蛋白重组杆状病毒及基因工程疫苗，属于生物制药领域。通过RT－PCR扩增兔病毒性出血症病毒衣壳蛋白VP60全基因，通过分子生物学技术构建杆状病毒重组载体，转染Sf9细胞，使VP60基因获得表达，然后以重组杆状病毒表达的兔病毒性出血症病毒衣壳蛋白VP60作为抗原，加上相应的佐剂制成兔病毒性出血症的基因工程疫苗。本发明可以提供一种免疫效果好、工艺简便的兔病毒性出血症病毒衣壳蛋白基因工程疫苗，用于预防控制兔病毒性出血症。

摘要： 本发明公开了一种RHDV VP10‑VP60重组蛋白，属于动物病毒抗体检测领域。所述重组蛋白包括SEQ ID NO.1所示氨基酸序列或由SEQ ID NO.1所示氨基酸序列组成。本发明还进一步公开了所述重组蛋白的基因，包含所述基因的载体和宿主细胞，以及所述重组蛋白的其制备方法和在检测RHDV的抗体中应用。利用本发明的重组蛋白检测RHDV抗体，方便快捷，灵敏度高，与其他病原体无交叉反应，特异性强，具有巨大的临床意义和和广泛的应用前景。

摘要： 本发明公开了一种兔出血症病毒、兔巴氏杆菌双重PCR快速检测方法，该方法根据兔出血症病毒VP60基因和兔巴氏杆菌kmt基因序列，设计了两对可扩增VP60基因和kmt基因的特异性引物。电泳图谱中出现645bp的特异性条带为兔出血症病毒阳性；出现215bp的特异性条带为兔巴氏杆菌阳性。研究表明，本发明可以在同一个反应体系中对兔出血症病毒和兔巴氏杆菌进行检测，具有快速、特异、敏感、稳定的特点，克服了常规诊断方法的不足，可用于兔病毒性出血症和兔巴氏杆菌病的快速鉴别诊断，对有效防控这两种疫病具有重要意义。

摘要： 本发明涉及兔出血症病毒杆状病毒载体、多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗及其制备方法，属于免疫技术领域。将重组兔出血症病毒VP60杆状病毒接种Sf9昆虫细胞，于27～28°C培养，待细胞病变达85%以上时，收获细胞培养物并灭活，以灭活物作为兔出血症病毒抗原；将兔源荚膜A群多杀性巴氏杆菌C51‑17菌株扩增培养，将菌液进行灭活，以灭活菌液作为多杀性巴氏杆菌抗原；将两种抗原与佐剂按比例混合制成兔出血症病毒杆状病毒载体、多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗。本发明可以提供一种安全性高、免疫效果好、工艺简便的兔出血症病毒杆状病毒载体、多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗，用于预防控制兔病毒性出血症（兔瘟）和兔多杀性巴氏杆菌病。

摘要： 本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种兔出血症病毒1型和2型VP60二价重组杆状病毒载体灭活疫苗及其制备方法和应用。本发明通过反转录PCR分别扩增兔出血症病毒1型和2型衣壳蛋白VP60基因，并将两种PCR产物克隆至具有双启动子的真核表达载体中，获得同时表达兔出血症病毒1型和2型VP60蛋白的重组杆状病毒。以重组杆状病毒表达的兔出血症病毒1型和2型VP60蛋白作为抗原，加入佐剂制成兔出血症病毒1型和2型VP60二价重组杆状病毒载体灭活疫苗。本发明可以提供一种免疫效果好、工艺简便的兔出血症病毒1型和2型VP60二价基因工程疫苗，用于预防和控制当前流行的兔出血症病毒1型和2型毒株。

摘要： 本发明公开了一种兔出血症病毒、兔巴氏杆菌双重PCR快速检测方法，该方法根据兔出血症病毒VP60基因和兔巴氏杆菌kmt基因序列，设计了两对可扩增VP60基因和kmt基因的特异性引物。电泳图谱中出现645bp的特异性条带为兔出血症病毒阳性；出现215bp的特异性条带为兔巴氏杆菌阳性。研究表明，本发明可以在同一个反应体系中对兔出血症病毒和兔巴氏杆菌进行检测，具有快速、特异、敏感、稳定的特点，克服了常规诊断方法的不足，可用于兔病毒性出血症和兔巴氏杆菌病的快速鉴别诊断，对有效防控这两种疫病具有重要意义。