体外表达

摘要： 在烟碱型乙酰胆碱受体家族中,含α6亚型的受体是比较特殊的一类.研究发现α6β4*亚型(*表示含其他亚基)在神经系统方面具有一定的调节作用,与神经性疼痛、成瘾等多种疾病的发病机制密切相关,可作为潜在的治疗靶点.比对大鼠与人类α6和β4亚基的序列,以野生型基因为模板,采用基因定点突变的方式,成功得到3种相邻位点突变的α6/α3β4受体突变型基因.通过体外转录、显微注射等手段,构建α6/α3β4受体野生型和突变型在非洲爪蟾卵母细胞上的表达模型,并使用双电极电压钳检测受体的表达情况.结果表明,与野生型受体相比,突变体α6/α3β4[S52N,I53V]对ACh的敏感性有所提升,EC50为59.58μmol·L?1,是野生型的1/2,而其他两种突变体的敏感性与野生型相同.

摘要： 防御素是广泛分布于动物、植物、昆虫体内的一类富含半胱氨酸的阳离子内源性抗菌肽,在动物免疫调节及植物自身防御方面扮演着重要的角色.对防御素的概念、类型、结构特征、作用机理进行了综述,总结了防御素在牛、马、羊、猪、鹿、骆驼等家畜体内组织表达及体外表达研究进展,并对防御素在未来生物制药和畜牧饲料生产方面的应用前景进行了展望.

摘要： Methylocorus sp.MP 688菌株具有高产吡咯喹啉醌的特性而应用于工业生产当中.分析其全基因组及代谢通路,发现在C1固定中丝氨酸循环起到重要的生理作用.为了研究丝氨酸循环中glyA基因是否具有表达丝氨酸羟甲基转移酶(serine hydroxymethyltransferase,SHMT)活性及基因缺失是否会对菌株生命活动产生影响.采用体外表达方式,纯化并检测glyA基因产物SHMT酶是否具有催化活性.通过双交换实验进行glyA基因敲除,探究glyA基因缺失是否会对菌株产生影响.结果表明,glyA基因成功在体外表达,双交换敲除实验证明glyA基因作为关键基因存在,其缺失或可致死.此外,SHMT酶在35°C,pH值7.5缓冲体系中酶促效率最高,还原剂β-巯基乙醇对SHMT酶催化活性具有促进作用.

摘要： 眼镜蛇毒神经毒素(Cobrotoxin,CT)是一种短链神经毒素,最早是从台湾眼镜蛇蛇毒中分离得到的.因其在镇痛和抗癌方面有着显著的效果而成为研究的热点,本文通过对近年来CT的结构、药理作用、镇痛、抗癌研究进展进行综述,旨在为各位研究者提供基础参考资料.

摘要： [目的]水通道蛋白是细胞膜内嵌蛋白超家族的主要成员,具有传输水分子以及小分子化合物进出细胞膜的功能,本研究目的是分析重要农业害虫灰飞虱体内水通道蛋白功能及其与杀虫剂代谢之间的关系。[方法]根据转录组数据,采用PCR和RACE技术对灰飞虱体内的水通道蛋白基因进行了克隆,并利用进化树对获得的基因进行亲缘关系的分析验证,利用实时荧光定量PCR技术分析这些基因在灰飞虱抗、感品系间的表达量差异,利用体外表达技术分析其转运活性。[结果]从灰飞虱体内克隆获得了6个灰飞虱水通道蛋白基因全长序列,分别命名为LsAQP1、LsAQP2、LsAQP3、LsAQP4、LsAQP5和LsAQP6,其中LsAQP6在灰飞虱的不同抗性品系里均高表达。体外功能表达试验显示:LsAQP6对水具有很强的转运能力,对灭多威也具有显著的转运能力,但对甘油和杀虫双的转运能力不显著。[结论]LsAQP6在灰飞虱体内对水和某些小分子农药具有转运作用。

摘要： 为探讨3种感染方法对不同发育阶段胚胎中EGFP基因表达影响,利用透明带下注射法、胞质内注射法及透明带切口与慢病毒共培养法感染1-细胞期小鼠胚胎,分别提取以上3种方法感染慢病毒的不同发育阶段胚胎的EGPF基因,并以其为模板,扩增出630bp的EGPF基因片段。结果表明：慢病毒转染后在不同发育阶段的胚胎中,均扩增出EGFP目的片段(630bp)。当透明带下注射病毒时,90pL注射组(C组)和60pL注射组(B组)的EGFP基因阳性率显著优于30pL注射组(A组)(p0.05)。透明带做切口的胚胎与含不同浓度慢病毒共培养时,从1-细胞期到4-细胞期胚胎为止组间差异不显著(p>0.05),而胚胎发育的后期2×103cfu•μL-1组和3×103cfu•μL-1组均极显著优于1×103cfu•μL-1组(p0.05)。透明带下注射慢病毒与胞质内注射慢病毒时,注射90pL(病毒滴度3×103cfu•μL-1)组的EGFP基因体外表达效果最好；透明带做切口的胚胎与含不同浓度慢病毒共培养时,在3×103cfu•μL-1滴度培养液中培养的EGFP基因体外表达效果最好。%In this research, transparent injection, cytoplasm injection and transparent incision with lentivirus co-culture method were used to infect 1-cell stage mouse embryos, and to explore the different developmental stages of embryos infected with EGFP gene expression in the three methods. EGPF gene was extracted from the above three methods of lentivirus infection in different developmental stages of embryos. With EGFP as a template, a 630bp segment of EGFP gene was amplified. Different developmental stages of embryos were transfected by lentivirus, and the amplified EGFP fragment (630bp) were obtained. When the virus was injected below transparent film, the EGFP gene positive rate of 90pL injection group (group C) and 60pL injection group (group B) was significantly better than that of 30pL injection group (group A) (p0.05). When the embryos with transparent incision were cultured with different concentrations of lentivirus, from 1-cell stage to 4-cell stage embryos among the groups were not significantly differnent (p>0.05), while later the 2×103 cfu•μL-1 group and 3×103 cfu•μL-1 group were significantly better than 1×103 cfu•μL-1 group(p0.05). Transparent film or cytoplasm injection with the lentivirus, 90pL (viral titer of 3×103 cfu•μL-1) injection group gave the best effect expression in vitro of EGFP gene; the embryos with transparent incision were cultured with different concentrations of lentivirus, 3×103 cfu•μL-1 titer group showed the best effect expression in vitro of EGFP gene.

摘要： Objective To explore the function of a novel nonsense mutation c.1476G＞A of ITGB3 gene using an in vitro expression system.Methods An eukaryotic expression vector containing ITGB3 c.1476G＞A eDNA was generated by site-directed mutagenesis and transformed into E.coli.Plasmid DNA was extracted and sequenced to confirm the target mutations.Wild-type and mutant recombination plasmids were transfected into Chinese hamster ovarian cancer (CHO) cells by nonliposome method,and the stable expression cells were harvested by G418 screening.The ITGB3 gene mRNA transcription and GP Ⅲ a expression level in CHO cells were detected with real-time quantitative PCR,Western blotting and flow cytometry,respectively.Results The eukaryotic expression vectors of wild ITGB3 cDNA and c.1476G＞A mutant were successfully constructed.CHO cells with stable expression were obtained after transfection and screening.Compared with the wild-type transfected cells,the amount of CD61 antigen expression was 37 ％ and mRNA transcription level was only 6％ in the mutant-transfected cells.Full length GPⅢ a protein was found only in the stably wild-type-transfected cells,but not in mutant-transfected cells by Western blotting analysis.Conclusion The ITGB3 c.1476G＞A mutation can decrease the transcription level and further affect GPⅢ a synthesis and CD61 antigen expression.%目的 对ITGB3基因新的终止突变c.1476G＞A进行体外表达研究,以阐明其功能.方法 应用体外定点诱变技术构建突变型ITGB3 c.1476G＞A cDNA的真核表达载体,转化感受态细胞,提取质粒后测序验证.采用非脂质体介导重组质粒转染中国仓鼠卵巢癌细胞株(Chinese hamster ovarian cancer,CHO)细胞,经G418筛选获取稳定表达细胞株.采用实时荧光定量PCR、Western印迹和流式细胞术分别检测CHO稳定表达株ITGB3基因的mRNA表达和血小板膜糖蛋白Ⅲa(glycoproteinⅢa,GPⅢa)糖蛋白水平.结果 成功构建野生型和突变型ITGB3 cDNA的真核表达载体,转染筛选后分别获得了稳定表达的CHO细胞株.突变型细胞株中CD61抗原表达量仅为野生型的37％,而ITGB3 mRNA转录水平为野生型的6％.Western印迹结果显示,野生型细胞株稳定表达完整的GPⅢa蛋白,而突变型CHO细胞株无完整的GPⅢa蛋白表达.结论ITGB3 c.1476G＞A终止突变可导致ITGB3基因的转录水平降低,影响GPⅢa蛋白合成及CD61抗原的表达水平.

摘要： 通过分析茶树咖啡碱合成途径中的N-甲基转移酶基因TCS1与ICS1、PCS1的蛋白质空间结构模型,找到了四个可能影响TCS1催化活性的关键位点进行定点突变,构建突变基因重组原核表达质粒pMAL-TMx并在表达菌株BL21(DE3)pLysS中高效表达.茶树咖啡碱合成酶TCS1的四个突变体分别是TM1:225位精氨酸(Arg)突变为组氨酸(His);TM2:317位缬氨酸(Val)突变为甲硫氨酸(Met);TM3:271位苯丙氨酸(Phe)突变为色氨酸(Trp);TM4:272位丙氨酸(Ala)突变为脯氨酸(Pro).基因TCS1 突变后,对表达的融合蛋白进行活性分析,突变体TMx 酶催化活性发生较大变化,其中TM1只具备3-N位甲基化活性,即只能催化7-MX合成可可碱;突变体TM2,TM3,TM4均能催化7-MX合成可可碱和咖啡碱,但催化能力有明显差异.

摘要： 本文对牛转录因子Oct-4, Sox2, Nanog，和Lin28的mRNA序列进行原核系统外源基因高效表达设计，并进行化学法合成，通过多次PCR的方法得到四个因子体外表达规律。结果通过四个因子体外表达规律图显示Oct4, Nanog, Sox2和Lin28基因中成簇的低利用率的密码子抑制了核糖体的运动，使得它们在大肠杆菌中不能以合适水平表达，因此，实现转录因子这样复杂的蛋白质的表达需要优化密码子。

摘要： 目的：克隆猪载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样蛋白3F(apolipoproteiIl B mRNA editing cnzymc,catalyticpolypeptide 3F,APOBEC3F)基因,构建真核表达载体实现其在体外表达与鉴定。方法：分离健康五指山猪外周血单个核细胞,TRIZO法提取细胞总RNA,RT-PCR技术特异性扩增目的基因,目的基因插入真核表达载体pDSredl-N1及改造的pCDNA3-Flage载体构建表达质粒并在PK-15细胞中进行表达,通过激光共聚焦纤维镜及Western blot方法对目的基因的表达进行鉴定。结果：克隆的目的基因与公布的基因序列同源性达99%;激光共聚焦显微镜显示目的基因在PK-15细胞中实现了表达,且表达产物定位于细胞浆内：westem blot鉴定结果表明,表达的目的蛋白大小与预期相符。结论：成功构建了猪APOBEC3F真核表达载体,为研究猪APOBEC3F分子抗猪内源性反转录病毒机制及单克隆抗体的制备提供了实验基础。

摘要： 目的：研究狂犬病病毒核蛋白在保护性免疫应答中的作用。方法：RT-PCR获得狂犬病病毒CVS-11株的核蛋白全长基因，并克隆至原核表达载体pET30a(+)，获得重组表达质粒pET30a-N，转染BL21（DE3）菌株，在体外进行核蛋白的表达，Ni2+柱纯化。纯化后核蛋白以氢氧化铝为佐剂免疫Balb/c小鼠，ELISA检测小鼠特异性抗核蛋白抗体，同时进行病毒攻击法以评价核蛋白所诱导的保护性免疫应答情况。结果本研究成功构建狂犬病病毒核蛋白重组表达质粒pET30a-N，并在体外获得高效表达和纯化核蛋白，目标蛋白主要以包涵体形式存在，占菌体总蛋白的35%左右。ELISA检测小鼠血清中抗核蛋白特异性抗体滴度对数的GMT值为 3.81± 0.22。加氢氧化铝佐剂的重组核蛋白免疫小鼠后进行狂犬病病毒CVS株攻击保护率可达41.7%。结论：狂犬病病毒核蛋白获得成功表达和纯化，数据显示具有良好的免疫原性，并可对狂犬病病毒攻击产生一定的保护效果。

摘要： 本研究从ConA刺激培养的SPF白来航鸡脾脏淋巴细胞中扩增鸡白细胞介素15(ChIL-15)全基因片段，将其克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+)中。应用磷酸钙转染法体外将含有目的基因的真核表达质粒pcDNA3.1(+)-ChIL-15转染293T细胞，通过间接免疫荧光试验(IFAT)检测ChIL-15蛋白在细胞中的表达，为ChIL-15作为免疫预防佐剂作用研究奠定必要基础。

摘要： 兔出血症病毒(RHDV)的基因组仅编码两个结构蛋白，其中一种为衣壳蛋白( VP60)，另一种为次结构蛋白(VP2)。目前，对衣壳蛋白的生物学功能已基本清楚。但是，关于次结构蛋白的生物学功能还不是很清楚。为此，本研究利用反向遗传学技术结合体外表达技术，系统研究了该蛋白的生物学功能。研究结果表明，RHDV的基因组缺失次结构蛋白(VP2)后，病毒的侵染性有所降低，但是病毒基因组的复制能力和衣壳蛋白的表达水平有所提高，说明VP2不是维持RHDV侵染性所必需的蛋白。体外研究也表明，VP2的缺失并不影响病毒样颗粒的组装，提示该蛋白不是组成病毒衣壳的组成成分。通过对接种VP2的细胞进行DAPI染色和DNA片断分析研究，发现VP2具有诱导宿主细胞凋亡的功能。由此，可以推测VP2可能在RHDV的致病机制过程发挥重要作用。

摘要： 本文从2004年全国动物流感调查分离到的一株猪流感病毒经亚型鉴定确定为H9N2,命名为A/Swine/Zhejiang/7/2004(H9N2),利用RT-PCR扩增HA基因,测序后将其克隆到真核表达载体pCAGGS上,转染293T细胞,经Western-blot检测所克隆的载体pCAGGHA在体外能够瞬时表达具有免疫学活性的HA蛋白,这将为下一步开展DNA疫苗的免疫奠定基础.

摘要： 本研究将去除信号肽的鸡IL-2(ChIL-2)基因亚克隆到原核表达载体pBAD/His B,构建重组表达载体pBAD-ChIL-2,重组载体转化菌株E.coli LMG194,用0.2﹪终浓度的L-(+)-阿拉伯糖进行诱导,实现了重组鸡IL-2(rChIL-2)蛋白在大肠杆菌的高效表达.

摘要： 不同物种间细胞在蛋白翻译过程中具有密码子使用的偏嗜性,鸡与A型流感病毒保护性免疫原HA蛋白氨基酸密码子使用频率存在着明显差异.为此,利用寡核苷酸合成、重叠延伸PCR及限制酶切法构建了密码子优化的A/Goose/GuangDong/1/96(H5N1)[GD/1/96(H5N1)]的HA基因(optiHA),并将其插入CMV启动子表达载体pCI构建了H5亚型DNA疫苗质粒pCIoptiHA,将含有GD/1/96(H5N1)野生型HA基因的质粒pCIHA和pCIoptiHA分别转染293T细胞,间接免疫荧光检测转染后24-48小时293T细胞中瞬时表达的HA抗原蛋白;Western-blot证实上述2种表达质粒均可正确表达H5亚型HA抗原蛋白,结果表明密码子优化的基因optiHA体外瞬时表达水平显著高于野生型HA基因.这一结果为进一步开展SPF鸡免疫保护效果的比较研究奠定了基础.

摘要： 探求端粒酶基因hTRT与细胞辐射敏感性的相关性.方法本课题通过端粒酶基因hTRT转染,构建端粒酶真核细胞重组体,运用集落形成法检测入端粒酶基因转染H460细胞、空载体转染H460细胞及正常H460细胞的辐射敏感性,以TRAP方法和FCM实验测定端粒酶活性和细胞增殖力的相应变化.结果外源性人端粒酶基因hTRT转染真核细胞后,可增加细胞的端粒酶活性,FCM实验表明同时增加了细胞的增殖能力,进一步提高了细胞的辐射敏感性.表明端粒酶基因hTRT可能是细胞辐射敏感性相关基因之一.

摘要： 本发明公开了一种梨PMEI蛋白的体外表达纯化方法及其应用。通过设计引物克隆梨PMEI基因；构建大肠杆菌重组表达质粒PMEI‑pCold‑TF；将构建的重组表达质粒PMEI‑pCold‑TF转化入大肠杆菌Rosetta(DE3)中，构建梨PMEI蛋白重组表达菌株；对重组菌株进行蛋白诱导表达，并用镍柱亲和层析法纯化重组梨PMEI蛋白；之后，用获得的重组梨PMEI蛋白处理梨花粉管及拟南芥根部。通过本发明的方法，实现了梨PMEI蛋白的首次体外表达及纯化，表达效率高，纯化蛋白稳定存在且纯度完全可以满足相关实验的需要；通过重组梨PMEI蛋白对梨花粉管和拟南芥根部的处理，促进了梨花粉管和拟南芥根部的生长。

摘要： 本发明公开了一种用于异源基因体外表达的密码子优化方法，该方法包括：获取宿主细胞全基因组的核苷酸序列和全蛋白组的氨基酸序列；以密码子对为统计对象，统计每个密码子对在宿主细胞全基因组中的权重；选定待优化蛋白，构建一个以密码子为节点、上下游密码子对间的权重值为线值的单向图模型；根据单向图模型，得到优化后基因的核苷酸序列。本发明利用宿主细胞的全基因组和全蛋白组作为序列库，以密码子对为统计对象，通过构建以密码子为节点、上下游密码子对间的权重值为线值的单向图模型，来获得最优的密码子组合顺序，得到具有最优化核苷酸序列的优化基因，该优化基因能够在体外高效表达，表达量显著提高。

摘要： 本发明提供了一种森林山蛭抗血栓多肽Sylvestin及其体外表达制备方法，属于多肽合成表达技术领域，所述多肽Sylvsetin的氨基酸序列如Seq ID No.1所示。本发明还提供了所述多肽Sylvestin的改造肽，所述改造肽的氨基酸序列如Seq ID No.5、Seq ID No.6、Seq ID No.7或Seq ID No.8所示。所述多肽Sylvestin及其改造肽具有FXIIa抑制活性，以及抗血栓和治疗中风的功效。本发明所述的体外表达制备方法，实现了山蛭Sylvestin多肽在原核生物体内的规模化、低成本生产，通过纯化应用于生物功能药物的制备。

摘要： 本发明公开了一种VEGF-C真核表达载体的构建和体外表达时RT-PCR的方法。取细胞总RNA约5ng,按cDNA第一链合成试剂盒说明书进行逆转录反应,引物为随机引物oligodt,反应总体积20μl；取2μl进行PCR反应,使用特异性引物,反应总体积50μl。所述反应在以下条件下进行：94°C5min,94°C30s,60°C30s,72°C1min循环35次,末次延伸72°C7min;取10μlPCR产物进行琼脂抗凝胶电泳鉴定,以β-actin为内对照。本发明的有益效果是，基因测序能够证实RT-PCR产物包含VEGF-CcDNA全长。重组pcDNA3.1(-)中含有VEGF-CcDNA全长序列,Western-blotting检测到细胞培养上清中以及细胞内有VEGF-C蛋白存在。成功构建了人类VEGF-C真核表达载体并检测到载体在真核细胞中的表达。

摘要： 本发明公开了一种VEGF-C真核表达载体的构建和体外表达的实验方法。在首先进行的MCF-7细胞培养与总RNA提取中，于DMEM培养基培养MCF细胞,胰酶消化传代。收集对数期生长的MCF-7细胞,总量为5～6×106；按Trizol试剂盒说明提取细胞总RNA；其中Trizol试剂盒,为cDNA第一链合成试剂。本发明的有益效果是，基因测序能够证实RT-PCR产物包含VEGF-CcDNA全长。重组pcDNA3.1(-)中含有VEGF-CcDNA全长序列,Western-blotting检测到细胞培养上清中以及细胞内有VEGF-C蛋白存在。结论:成功构建了人类VEGF-C真核表达载体并检测到载体在真核细胞中的表达。

摘要： 本发明在蛋白体外表达的生产中，将盛放反应液的反应容器连接在一旋转装置的与地面倾斜向上设置的转轴上，在进行蛋白体外表达时，所述反应容器在所述转轴的驱动下自转，使得反应液在摩擦力、表面张力和重力作用下，跟随所述反应容器的底面转动，从而在与水平面倾斜的平面上摊开，分布于所述反应容器的底面及内壁面上，强迫形成薄层。而实验表明，当体外无细胞蛋白合成体系的反应液在反应容器中的厚度控制得比较薄时，其反应活性好于较厚时的反应活性。转动还起到搅拌效果。本发明应用于工业生产中，可以使用大容器进行蛋白体外合成，一次性处理较大体积的IVTT反应液，以实现通过单次反应就获得较高产量的蛋白质，从而大大提高蛋白体外表达的效率。

摘要： 本发明涉及基因工程，为了更好地制备胞外超氧化物歧化酶，提供了一种体外表达牦牛胞外超氧化物歧化酶SOD3的方法，包括如下操作步骤：(1)重组目的片段与表达载体；(2)构建工程质粒或工程菌；(3)在宿主细胞中实现表达；(4)重组蛋白的鉴定方法。本发明的体外表达牦牛胞外超氧化物歧化酶SOD3的方法，能够有效地表达SOD3。

摘要： 本发明公开了一种梨PMEI蛋白的体外表达纯化方法及其应用。通过设计引物克隆梨PMEI基因；构建大肠杆菌重组表达质粒PMEI‑pCold‑TF；将构建的重组表达质粒PMEI‑pCold‑TF转化入大肠杆菌Rosetta(DE3)中，构建梨PMEI蛋白重组表达菌株；对重组菌株进行蛋白诱导表达，并用镍柱亲和层析法纯化重组梨PMEI蛋白；之后，用获得的重组梨PMEI蛋白处理梨花粉管及拟南芥根部。通过本发明的方法，实现了梨PMEI蛋白的首次体外表达及纯化，表达效率高，纯化蛋白稳定存在且纯度完全可以满足相关实验的需要；通过重组梨PMEI蛋白对梨花粉管和拟南芥根部的处理，促进了梨花粉管和拟南芥根部的生长。

摘要： 本发明公开了一种体外表达mRNA的质粒载体及其构建方法和应用。该质粒载体包括位于待插入表达的基因尾部3’‑端的长度大于30的多聚腺苷脱氧核酸poly(A)片段。本发明构建的体外表达mRNA的质粒载体，包括表达目标蛋白基因和60个poly(A)，表达的mRNA直接拥有poly(A)，不需要额外的加尾操作。另外，体外转录所得mRNA在转染细胞后，呈现出更强的mRNA稳定性和更高的蛋白表达能力检测。

摘要： 本发明公开了一种重组果胶甲酯酶PbrPME的体外表达方法及其编码基因与应用。通过设计引物克隆梨PbrPME基因；构建大肠杆菌重组表达载体PbrPME‑pCold‑TF；将构建的重组表达载体PbrPME‑pCold‑TF转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)中，构建表达梨PbrPME蛋白的重组菌株；对重组菌株进行表达，并用镍柱亲和层析法纯化重组梨PbrPME蛋白；利用重组梨PbrPME蛋白处理梨花粉管，统计处理后花粉管长度，验证重组梨PbrPME蛋白活性。通过本发明的方法，实现了梨PbrPME蛋白的体外表达及其应用，完全可以满足相关实验的需求。