人偏肺病毒

摘要： 目的:研究重组酶聚合酶扩增技术在人偏肺病毒(hMPV)快速诊断的方法 建立与临床价值.方法:将2017年1月—2019年12月医院收治的急性呼吸道感染患儿200例纳入研究.分离获取hMPV阳性病毒株,检索Genbank数据库,检索hMPV株基因序列,采用生物信息学软件通过靶向特定区域,对hMPV的N基因和L基因2个位点进行检测,并设计引物及荧光探针,使用病毒株和阴性对照品对基于重组酶聚合酶扩增技术快速检测hMPV的方法 进行性能评估.同时,对所有受试者均进行直接荧光免疫法检测.以逆转录—聚合酶反应(RT-PCR)检测结果 为金标准,对比不同检测方式诊断hMPV的效能.此外,分析hMPV感染患者合并其他病毒感染情况.结果:以RT-PCR检测结果 为金标准,重组酶聚合酶扩增技术诊断hMPV的灵敏度、特异度、准确度均明显高于直接荧光免疫法检测(均P<0.05).hMPV感染患者合并其他病毒感染发生率为26.83％,其中主要涵盖冠状病毒9.76％、呼吸道合胞病毒7.32％、流感病毒4.88％等.结论:重组酶聚合酶扩增技术在hMPV快速诊断中的应用效果较佳,可获得较为理想的灵敏度、特异度以及准确度,有望成为替代传统PCR的有效检测方式,值得临床推广应用.

摘要： 目的 探讨辛伐他汀预处理对人偏肺病毒(hMPV)感染的作用及相关机制.方法 体外实验使用人支气管上皮细胞16HBE,体内实验使用BALB/c小鼠,均随机分为对照组、辛伐他汀组、hMPV组及hMPV+辛伐他汀组,各组经相应处理后,显微镜观察病毒荧光表达情况,实时荧光定量PCR检测病毒滴度及自噬相关基因重组人自体吞噬相关蛋白5(ATG5)、Beclin1、微管相关蛋白1轻链3(LC3)mRNA的表达,Western blotting检测自噬相关蛋白ATG5、Beclin1、LC3以及丝氨酸/苏氨酸激酶/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(AKT/mTOR)通路蛋白表达情况.结果 在体外实验中,hMPV+辛伐他汀组的病毒直接及间接荧光表达以及病毒滴度(0.260±0.018)均低于hMPV组(1.241±0.030),但自噬相关基因ATG5(7.31±0.15)、Beclin1(8.67±0.88)、LC3(6.55±0.30)的mRNA表达水平均高于对照组[分别为(1.00±0.06)、(1.00±0.05)、(1.10±0.06)];hMPV+辛伐他汀组自噬相关基因的mRNA及蛋白水平表达最高,差异均有统计学意义(P<0.05);hMPV组及hMPV+辛伐他汀组的AKT/mTOR通路被抑制.在体内实验中,hMPV+辛伐他汀组的肺组织病毒滴度(0.75±0.26)以及肺组织研磨上清接种于Vero E6中的病毒滴度(0.42±0.17)均低于hMPV组(分别为2.46±0.53及1.80±0.40),ATG5(3.89±0.42)、Beclin1(3.13±0.26)、LC3(3.56±0.22)mRNA及蛋白表达水平高于对照组及hMPV组,差异均有统计学意义(P<0.05),且AKT/mTOR通路被抑制,肺组织HE染色显示hMPV组有炎症反应,辛伐他汀预处理能减弱炎症反应.结论 辛伐他汀预处理可减少hMPV感染,该过程有自噬参与且与AKT/mTOR通路相关.

摘要： 目的 了解2017年北京市朝阳区流感样病例(influenza-like illness,ILI)病原谱和人偏肺病毒(human metapneumovirus,hMPV)感染情况.方法 收集2017年1-12月ILI样本,使用荧光定量PCR检测10种常见呼吸道病原体,包括流感病毒、鼻病毒、支原体等,对偏肺病毒阳性样本进行分型检测.结果 2 189份ILI样本中检出639份阳性样本.病原谱构成前四位为流感病毒、鼻病毒、支原体和副流感病毒;共检出16份hMPV样本,主要在冬春季流行,分型结果显示有5份B1亚型和1份A2亚型.结论 流感病毒、鼻病毒、支原体和副流感病毒是2017年朝阳区ILI的主要病原体;hMPV流行具有季节性,并以B1亚型流行为主.

摘要： 目的 了解人偏肺病毒和博卡病毒在肺炎住院儿童中的分子流行及临床特征.方法 2017年11月至2018年5月收集因社区获得性肺炎在承德医学院第二临床学院儿科住院儿童的咽拭子标本333份,并收集患者的临床信息.血清学检测腺病毒,呼吸道合胞病毒,流感病毒,副流感病毒的IgM抗体,RT-PCR或PCR检测人偏肺病毒,人博卡病毒,腺病毒,呼吸道合胞病毒和人冠状病毒.结果 血清学检测显示43例患者为乙型流感病毒IgM阳性、19例患者为副流感病毒IgM阳性、3例患者为呼吸道合胞病毒IgM阳性、2例患者为腺病毒IgM阳性.PCR或RT-PCR结果 显示80例患者为人偏肺病毒感染(其中71例为单独感染、8例为共感染、1例为三重感染)、22例患者为人博卡病毒感染(其中14例为单独感染、7例为共感染、1例为三重感染)、6例患者为腺病毒感染(其中4例为单独感染、1例为共感染、1例为三重感染)、呼吸道合胞病毒和人冠状病毒感染患者各1例且为单独感染.80例人偏肺病毒感染患者中5岁以下患者为39例(11.7％)、5岁以上患者为41例(12.3％).重症组病毒阳性率为45.0％(18/40),轻症组病毒阳性率为27.99％(82/293),重症组病毒阳性率高于轻症组(P=0.042).重症患者在年龄(P=0.000)、发热高峰(P=0.035)、住院时间(P=0.000)、中性粒细胞比例(P=0.000)和淋巴细胞比例(P=0.000)与轻症患者相比有显著差异.结论 多种呼吸道病毒感染可引起社区获得性肺炎、应加强对人偏肺病毒和人博卡病毒的流行监测.%Objective To study the molecular prevalence and clinical characteristics of human metapneumovirus and human bocavirus in hospitalized children with community-acquired pneumonia. Methods Total 333 throat swabs and clinical information of patients were collected between 2017 and 2018at Department of Pediatrics of No. 2 Clinical Teaching Hospital, Chengde Medical University. The IgM of adenovirus ( AdV ) , respiratory syncytial virus ( RSV ) , influenza virus-A/B ( Influ-A/B ) , parainfluenza viruses ( PIVs) were tested by detection kit, and the positive samples of human metapneumovirus ( hMPV) , human bocavirus ( HBoV) , AdV, RSV and human coronavirus ( HCoV) were detected by RT-PCR or PCR. Results 43 cases, 19 cases, 3 cases and 2 cases were positive for Influ-B, PIV, RSV and AdV IgM, respectively. Total 80 cases were infected with hMPV (71 cases were single infection, 8 cases were double infection, and 1 case was triple infection ) , 22 cases were infected with HBoV ( 14 cases were single infection, 7 cases were double infection, and 1 case was triple infection) , 6 cases were infected with AdV (4 cases were single infection, 1 case was double infection, and 1 case was triple infection), only 1 case was single infected with RSV or HCoV, respectively. 39 cases ( 11. 7％) and 41 cases ( 12. 3％) were distributed at <5 years group and ≥5 years group, respectively. 45. 0％( 18/40 ) in severe cases and 27. 99％(82/293)in mild cases were positive for hMPV, HBoV, AdV, RSV and HCoV, the ratio of viral positive case was significant higher in severe cases than mild cases ( P=0. 042 ) . The age ( P=0. 000 ) , peak of fever ( P = 0. 035 ) , duration of hospitalization ( P = 0. 000 ) , neutrophils ( P = 0. 000 ) and lymphocytes ( P=0. 000) were significant difference in severe cases compared with mild cases. Conclusions Multiple respiratory viruses can cause community-acquired pneumonia and more attention should be pay to the surveillance of hMPV and HBoV.

摘要： Objective To construct and rescue recombinant influenza virus strains expressing hu-man metapneumovirus ( hMPV) epitopes. -ethods B cell, CTL and Th epitopes predicted by bioinformat-ics software were coupled together in different combinations. These different array genes were inserted into the NS1 gene of influenza virus strain A/PR/8/34 ( PR8 ) , respectively. Recombinant PR8 influenza virus vectors expressing different hMPV antigenic epitopes were rescued by reverse genetics using eight-plasmid system. Sequencing analysis was conducted to verify whether the rescued viruses carried the chimeric hMPV epitopes. Hemagglutination ( HA) titers, half tissue culture infection dose ( TCID50 ) and growth curves were detected. Results Interval sequences GPGPG and KK were introduced into hMPV epitope combinations to construct multi-epitope antigens (MEA). These MEA were inserted into the PR8 NS gene, respectively. Using 8 plasmid system, three recombinant influenza virus strains were rescued successfully. After cultured for three passages in Madin-Darby canine kidney ( MDCK) cells and one in eggs, these three recombinant strains could proliferate steadily. Whole genome sequencing verified that the three recombinant strains car-ried the chimeric MEA sequences, named as rFLU/hMPV/B, rFLU/hMPV/CTL-Th and rFLU/hMPV/B-Th. HA titers of the recombinant strains were 128, 128 and 256 using turkey erythrocyte, respectively. Their TCID50 were 107. 0/ml, 106. 8/ml and 107. 0/ml, respectively. Growth curve tests also verified that the recombinant strains could proliferate steadily in MDCK cells. Conclusions Three recombinant influenza vi-rus vector strains carrying the B cell, CTL and Th epitopes of hMPV were rescued successfully. This study lays the foundation for further evaluation of the immune effects of these recombinant viruses and their poten-tial application value in vaccine development.%目的 构建和拯救重组嵌合表达人偏肺病毒(human metapneumovirus,hMPV)表位的流感病毒株.方法 将通过生物信息学软件预测的hMPV B细胞表位、CTL表位和Th表位串联为不同表位组合,将其表位蛋白基因分别插入A/PR/8/34(PR8)流感病毒非结构蛋白NS1基因,利用8质粒系统共转染293T/MDCK细胞,拯救重组流感病毒毒株,全基因组测序鉴定重组流感病毒.同时测定重组病毒的血凝素(HA)活性和半数细胞感染量(TCID50)及生长曲线.结果 在hMPV不同表位间引入间隔序列GPGPG和KK,构建串联多表位抗原,将该抗原基因插入PR8流感病毒非结构蛋白NS基因,经反向遗传学成功拯救出3株重组流感病毒毒株.经MDCK细胞传代3次,鸡胚传代1次,3株重组流感病毒毒株增殖稳定.流感病毒全基因组测序证实,重组的3株流感病毒毒株分别嵌入了hMPV的B细胞表位、CTL表位/Th细胞表位和B细胞表位/Th细胞表位,命名为rFLU/hMPV/B、rFLU/hMPV/CTL-Th、rFLU/hMPV/B-Th.HA滴度分别为128、128、256,TCID50分别为107.0/ml、106.8/ml和107.0/ml.生长曲线试验结果表明重组流感病毒毒株可在MDCK细胞中有效复制.结论 成功拯救出3株嵌合有hMPV B细胞表位、CTL表位/Th细胞表位和B细胞表位/Th细胞表位的重组流感病毒株,为后续评价该重组病毒株的免疫效果及是否有潜在疫苗应用价值提供实验资料.

摘要： 目的 了解2010-2016年江西省2438例急性呼吸道感染儿童中人偏肺病毒感染情况和病毒基因型特征.方法 于2010年4月至2016年12月采集江西地区呼吸道感染儿童鼻咽拭子或支气管灌洗液标本;采用RT-PCR方法对人偏肺病毒进行核酸检测,对人偏肺病毒核酸阳性样本进行F基因扩增和测序,采用DNAStar和MEGA6.0软件对所得基因序列进行分析.结果 2010-2016年共采集2438例急性呼吸道感染儿童呼吸道标本.其中54例患儿标本人偏肺病毒核酸阳性,阳性率为2.21％,5岁以下儿童占总病例数90.74％.不同月份间人偏肺病毒检出率差异具有统计学意义,主要流行月份在12月和1-3月;阳性率在男女性别分布差异无统计学意义,共测序获得28株人偏肺病毒的F基因序列,系统进化分析显示,江西地区流行的人偏肺病毒有A2,B1,B2基因型,其中以A2基因型为主.结论 人偏肺病毒是引起江西省儿童急性呼吸道病毒感染的重要病原体之一,冬春季高发,A2为优势流行的基因型.

摘要： 目的:观察比较实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)与直接免疫荧光检测技术检测呼吸道标本人偏肺病毒(HMPV)的特异性与灵敏度;了解HMPV感染现状及其临床特征.方法:自行设计引物,建立检测HMPV荧光定量PCR的方法.与直接免疫荧光检测技术比较,对623例下呼吸道感染患儿的临床标本进行了检测与分析.结果:1.以HMPV作为模板进行荧光定量PCR获得阳性结果，但对其它常见呼吸道病毒PCR均阴性。2.623例样本中直接免疫荧光法检出HMPV感染共10例，检出率1.61 %.荧光定量PCR检出日MPV感染共28例，检出率4.49%，两种方法检出率有统计学差异。3.直接免疫荧光法阳性者10份PCR均阳性，595份两者均阴性，18份标本直接免疫荧光法阴性PCR呈阳性，显示很好的相关性。4.哮喘患儿中HMPV检出率为15.4%,4/26)，显著高于肺炎组(20/515,3.9%)、毛细支气管炎组(4/46,8.7%)，气管支气管炎组(0/36,0%)差异具有统计意义。5. HMPV检出率与年龄有关，0-1岁阳性率2.2%(9/404),-3岁13.1%(16/122)，-6岁3.4%(2/58)＞6岁2.6%(1/39)，其中1-3岁年龄组患儿HMPV检出率明显高于其它组，统计学差异显著。结论:1.荧光定量RT-PCR检测日MPV敏感性明显高于直接免疫荧光法，具有快速、准确的优点;2.哮喘患儿中HMPV检出率明显高于肺炎患儿;3.HMPV感染以1-3岁幼儿发生率最高。

摘要： 文章介绍了人偏肺病毒研究进展，病原学分析、流行病学特征、hMPV的临床表现、hMPY的实验室诊断方法、疫苗研制进程。

摘要： @@观察人偏肺病毒及呼吸道合胞病毒感染人肺上皮细胞及小鼠后，细胞及小鼠肺组织Toll样受体表达变化，探讨hMPV及RSV诱导气道炎症的部分机制及二者的异同。

摘要： @@通过GFP-rhMPV F蛋白N-糖基化位点发生突变的几种毒株间的比较研究，初步探讨hMPV F蛋白表面的N-糖基化位点改变对病毒毒力及其致病性的影响。GFP-rhMPV（为方便后述记为MO）(代表株NL/1/00)均为我室成功拯救的重组人偏肺病毒，全长质粒及主要病毒蛋白表达质粒均受赠于荷兰Erasmus研究所Fouchier教授。

摘要： 近年来人偏肺病毒(humanmetapneumovirus,HMPV)已和呼吸道合胞病毒、腺病毒等一样被认为是导致小儿急性呼吸道感染的主要病原。本文就HMPV的流行病学、临床特征、病毒检测和治疗等问题作一概述，以引起临床医生对病毒感染谱中的这一新成员的重视。

摘要： 急性呼吸道感染(ARI)是儿童最主要的病因及死因，全球每年约190万5岁以下儿童死于急性下呼吸道感染，其中发展中国家病死率尤高。儿童ARI最常见的病因为病毒，除呼吸道合胞病毒、腺病毒、流感病毒、副流感病毒等此前已较为充分认识的呼吸道病毒病原之外，新发呼吸道病毒（Emerging respiratory viruses）如人偏肺病毒(Human metapneumovirus，hMPV)、人博卡病毒(Human bocavirus，hBoV)和冠状病毒等在儿童急性呼吸道感染和哮喘等相关疾病中的重要作用亦受到广泛关注。

摘要： 本发明涉及鼠类单克隆抗体，其相应于由被命名为3G8/C11和7G4/A12的杂交瘤细胞系所分泌的单克隆抗体，并且针对hMPV的M抗原进行反应。这些抗体相互之间不竞争与所述抗原的结合位点，也不对于与所述抗原的同时结合施加障碍。所述单克隆抗体可以用于hMPV感染的检测、诊断和/或测定的检定试验。

摘要： 本发明涉及鼠类单克隆抗体，其相应于由被命名为3G8/C11和7G4/A12的杂交瘤细胞系所分泌的单克隆抗体，并且针对hMPV的M抗原进行反应。这些抗体相互之间不竞争与所述抗原的结合位点，也不对于与所述抗原的同时结合施加障碍。所述单克隆抗体可以用于hMPV感染的检测、诊断和/或测定的检定试验。

摘要： 本发明属于生物技术应用领域，涉及一种同时检测人A型、B型呼吸道合胞病毒及人偏肺病毒的含内质控的多重荧光RT-PCR方法及试剂盒。本发明针对人A型、B型呼吸道合胞病毒及人偏肺病毒代表株的N基因、L基因及L基因的保守序列设计特异性引物和探针，建立了含内质控的一步法多重荧光RT-PCR快速检测方法，操作简便快捷，克服了常规单重荧光RT-PCR单孔单检的繁琐，简化了操作程序，节省了试验成本，利用其较高的特异性、灵敏度、高效性和稳定性为病毒的现场检测、卫生评价、临床诊断等方面提供了有力的技术支撑。

摘要： 本发明涉及人偏肺病毒多表位抗原及其应用，所述人偏肺病毒多表位抗原由B细胞表位、Th细胞表位、CTL细胞表位序列组合而成，通过串联方式，并用连接子将上述各类型表位序列连接在一起。本发明还提供所述人偏肺病毒B细胞表位、CTL细胞表位和Th细胞表位基因片段的制备、串联及表达，制备人偏肺病毒多表位抗原，并评价其激活细胞免疫和体液免疫应答水平。通过评价实验表明，本发明的人偏肺病毒多表位抗原既可激活细胞免疫中的CTL免疫和Th免疫，也可激活体液免疫，体外实验对hMPV有一定中和作用，其可用于表位疫苗的开发，建立免疫学诊断方法，疾病流行病学研究以及hMPV感染的免疫治疗等。

摘要： 本发明提供了一种检测A型和B型流感病毒、人偏肺病毒，NL63型、HKU1型和OC43型人冠状病毒的试剂盒，包括病原体特异性引物和病原体基因探针。本发明的上述检测A型和B型流感病毒、人偏肺病毒，以及NL63型、HKU1型和OC43型人冠状病毒的试剂盒，基于多重荧光实时PCR和Tem-PCR技术之上，采用特异性设计的病原体引物和病原体基因探针，进行RT-PCR，可以大大提高了扩增效率，从而用普通的TaqDNA聚合酶仍能使检测结果具有很高的检测灵敏度，解决了传统多重PCR扩增效率低和检测灵敏度低的问题。

摘要： 本发明属于生物技术应用领域，涉及一种同时检测人A型、B型呼吸道合胞病毒及人偏肺病毒的含内质控的多重荧光RT-PCR方法及试剂盒。本发明针对人A型、B型呼吸道合胞病毒及人偏肺病毒代表株的N基因、L基因及L基因的保守序列设计特异性引物和探针，建立了含内质控的一步法多重荧光RT-PCR快速检测方法，操作简便快捷，克服了常规单重荧光RT-PCR单孔单检的繁琐，简化了操作程序，节省了试验成本，利用其较高的特异性、灵敏度、高效性和稳定性为病毒的现场检测、卫生评价、临床诊断等方面提供了有力的技术支撑。

摘要： 本发明提供一种人偏肺病毒高效感染人细胞的方法，包括将人偏肺病毒接种于人细胞中，离心，得到被病毒高效感染的人细胞。本发明通过离心实现人偏肺病毒对人细胞的高效感染，为今后病毒的分离和感染免疫研究奠定基础。

摘要： 本发明提供与人偏肺病毒(human metapneumovirus)的F蛋白质特异性结合且中和人偏肺病毒的新的人来源的单克隆抗体及其抗原结合性片段，并且提供含有该抗体或其抗原结合性片段的药物组合物。

摘要： 本发明公开了一种人偏肺病毒的MNP标记位点、引物组合物、试剂盒及其应用，所述MNP标记位点是指在人偏肺病毒基因组上筛选的区分于其他物种且在物种内部具有多个核苷酸多态性的基因组区域，包括MNP‑1～MNP‑11的标记位点；所述引物如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.22所示。所述MNP标记位点能特异的鉴定人偏肺病毒并精细的区分不同的亚型；所述引物互不干扰，综合多重扩增和测序技术，可一次性对多样本的所有标记位点进行序列分析，具有高通量、多靶点、高灵敏和检测低频变异的优势，可应用于大规模样本的人偏肺病毒的鉴定和遗传变异检测，对人偏肺病毒的科研、退化监测具有重要意义。

摘要： 本发明提供了一种人偏肺病毒HMPV培养方法及其产物和应用。本发明的人偏肺病毒的培养方法是使用幼仓鼠肾细胞系BHK作为人偏肺病毒的宿主，按照BHK细胞准备——HMPV接种——HMPV培养——HMPV收获进行。本发明还提供了通过上述培养方法获得的人偏肺病毒和BHK细胞系培养物。本发明的培养方法优化了HMPV的培养操作方法、缩短培养时间、提高标本分离成功率和产出病毒液浓度，为人偏肺病毒体外诊断试剂、药物、抗体、疫苗的研发生产提供了较好的基础，为人偏肺病毒生物检定参考品研发与生产提供了充足的原料，同时也为建立鉴定人偏肺病毒感染金标准方法奠定了较好的基础。