高通量筛选

摘要： 背景:Muse细胞在再生医学中具有巨大的医疗潜力,但目前其体外培养需要通过细胞簇悬浮的方法,不利于大规模扩增和应用.蛋白质是细胞外基质的重要组成部分之一,不同的蛋白质在细胞生长过程中起着不同的作用,因此可以通过高通量的方法快速筛选有利于Muse细胞在二维表面黏附扩增的蛋白质基质材料.目的:选出合适的蛋白质基材,用于Muse细胞的表面黏附培养和传代.方法:以牛血清白蛋白、牛血纤维蛋白原和明胶为原料,通过喷墨打印进行点样和蛋白质两两物理混合,制备成蛋白微点阵列芯片,利用高通量筛选方法选出适合Muse细胞黏附的最佳蛋白质组合.采用常规方法在蛋白基材表面进行Muse细胞传代培养并进行表征.结果 与结论:①由高通量筛选出两种有利于原代Muse细胞黏附的蛋白组合,两种组合分别为:牛血清白蛋白与明胶、牛血纤维蛋白原与明胶,组合比例均为7/17;②利用CCK8法测试原代Muse细胞在两种组合蛋白包被板的生长状况,各组细胞都呈现正常的增殖情况;经过6 d的培养,在牛血纤维蛋白原与明胶组合包被板上培养的细胞呈现较好的增殖状态;③通过对在蛋白包被板上传代培养的1代及3代Muse细胞的免疫荧光染色结果进行分析,结果显示,由牛血纤维蛋白原和明胶按7/17比例混合制备的基材能支持Muse细胞至少3代的黏附培养与扩增,并且维持较好的干细胞特性.

摘要： 为了获得低产高级醇的工业酿酒酵母菌株,以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株680bg为出发菌株,运用常压室温等离子体(atmospheric and room temperature plasma, ARTP)对其进行不同时长的诱变处理,结合孔板培养和分光光度法检测,建立了高通量筛选体系。最终,筛选获得了8株低产高级醇的酵母菌株,其中菌株ARTP-162的高级醇产量下降最为显著,降低了约21%,且遗传性能稳定。

摘要： 目的利用膜电位检测原理,构建一种靶向γ-氨基丁酸A型受体(GABA_(A)R)的药物高通量筛选模型。方法采用α_(1)β_(2)γ_(2L)-GABA_(A)R-CHO细胞株构建GABA_(A)R药物高通量筛选方法;分别以工具化合物的50%激动效应浓度(EC_(50))和EC_(80)浓度下的激活值(ASV)和Z′因子作为判定指标,对缓冲液反应体系、激动剂GABA激活浓度、染料种类和染料孵育时间进行优化选择;在优化条件下分别利用激动剂GABA(0.05,0.25和1.00μmol·L^(-1))、阳性变构剂地西泮(Dia,1,5和30μmol·L^(-1))和拮抗剂加巴嗪(gabazine,Gab,0.1,1.0和10.0μmol·L^(-1))进行方法稳定性考察;通过工具化合物GABA,Dia和Gab的剂量-效应关系检测,考察方法灵敏度。结果构建的方法分别实现了对不同药理性质化合物GABA,Dia和Gab的特异性检测;通过方法优化获得的优化条件为:在GABAEC_(20)~EC_(50)激活浓度下,采用5μL含氯体系加样,对使用红色染料孵育30~50 min的GABAAR-CHO细胞进行工具化合物检测;对不同浓度GABA,Dia和Gab检测的CV%分别介于4.09%~15.30%,5.59%~8.30%和5.65%~15.64%;通过对3种工具化合物的剂量-效应关系检测,获得GABA和Dia的EC_(50)值分别为(137.4±26.3)nmol·L^(-1)和(3.5±0.7)μmol·L^(-1),Gab的50%抑制效应浓度为(164.9±36.6)nmol·L^(-1)。结论本研究建立并优化了高通量检测方法,该方法特异性好、精密度高、稳定可靠、灵敏度高,为靶向GABA_(A)R的先导化合物发现提供了良好的技术基础。

摘要： 目的分析外泌体环状RNA(circular RNA,circRNA)在肝癌患者血清中的表达谱差异及临床意义。方法对上海市公共卫生临床中心2018年收治的3例肝癌患者和3例健康志愿者血清样本,利用总外泌体分离试剂盒分离血清中的外泌体,利用透射电镜、纳米颗粒跟踪分析和Western blotting对外泌体进行鉴定,利用高通量芯片技术检测circRNA表达谱差异。采用实时定量PCR方法验证62例肝癌患者血清circRNA分子的表达情况。分析表达异常的hsa_circ_0002018与肝癌患者临床病理特征的关系。结果分离得到的外泌体为圆形、双层膜囊状的颗粒,粒径约100 nm,标志蛋白CD9/CD63表达显著。肝癌患者血清及健康志愿者血清的样本间差异表达的circRNA(相对表达量差异倍数>2且P0.05)。circNFIC高表达组患者的总体生存期显著低于低表达组患者[(24.35±3.09)个月vs(31.49±2.95)个月,P<0.05]。结论肝癌患者血清外泌体中circRNA表达谱发生显著变化,其中circNFIC水平升高与肝癌进展和生存密切相关,通过测定血清外泌体内circNFIC的水平有助于肝癌的临床诊断和预后判断。

摘要： 目的探讨糖尿病性白内障患者晶状体上皮细胞(LEC)高表达的miR-124在糖尿病性白内障病理反应中的作用及机制。方法收集糖尿病性白内障患者与健康捐献眼的晶状体前囊膜,并通过高通量测序技术对晶状体前囊膜中的miRNA进行检测。使用EdgeR,利用F检验筛选差异表达miRNA。使用RegRNA检测差异表达miRNA和靶基因的结合关系以及结合位点,并进一步使用qRT-PCR验证miR-124和Bcl-2表达量的相关性。采用人LEC细胞分别转染dsControl、miR-124 inhibitor、dsBcl-2-640、miR-124 inhibitor+dsBcl-2-640,使用Western Blot检测Bcl-2表达量的变化;将各组细胞置于35.5 mmol·L^(-1)高糖环境中培养48 h,利用流式细胞术检测细胞凋亡率。结果糖尿病性白内障眼和健康对照眼miR-124丰度值分别为281208和64669(变化倍数为2.26,P0.05]。与空白对照组相比,miR-124 inhibitor组LEC细胞凋亡率显著降低[(11.33±1.86)%比(25.81±2.33)%,P0.05]。结论糖尿病性白内障患者LEC高表达的miR-124可靶向Bcl-2启动子序列诱导LEC细胞凋亡。

摘要： 全局转录机器工程(global transcription machinery engineering,gTME)采用微生物作为“细胞工厂”从转录水平扰动基因表达,直接或间接操纵全局转录调控网络,是一种在基因和细胞水平改造微生物、强化目标性能的高效方法。近年来gTME在增强菌株耐受性、提高应答反应能力、高产代谢产物等方面被广泛应用,较传统方法具有快速优化代谢途径、显著提高产物效率等优势。该文综述了gTME分子机制、在应变工程和代谢工程中最新进展及相配合的进化手段,以及高通量筛选策略,以期为微生物改造和代谢工程研究提供帮助。

摘要： 目的:研究小枝玫瑰花降脂降糖活性高通量筛选。方法:采用高通量筛选法,通过抑制胰脂肪酶、羧酸酯酶1、羧酸酯酶2,筛选小枝玫瑰花总黄酮降血脂活性;通过抑制α-糖苷酶,筛选小枝玫瑰花总黄酮降血糖活性。结果:小枝玫瑰花总黄酮对胰脂肪酶的IC_(50)为0.25±0.02μg/mL,对脂肪酶的抑制活性很强。对α-糖苷酶的IC_(50)为10.7±1.45μg/mL,对α-糖苷酶的抑制活性很强。小枝玫瑰花总黄酮对人羧酸酯酶1、羧酸酯酶2没有抑制作用。结论:通过高通量筛选,小枝玫瑰花总黄酮有降血脂、降血糖生物活性,有利于小枝玫瑰花的深度开发。

摘要： 聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)是世界上最常见且用途广泛的热塑性聚酯塑料。由于PET具有较高的化学惰性和环境稳定性,使用后处理不当的PET废弃物在全球范围内持续积累,造成了环境污染和生态危机。近年来,在塑料循环经济的框架内,开发新型PET废弃物回收和升级改造技术成为全球关注的发展方向之一。自然界中丰富的微生物资源为发掘、改造酶生物催化剂用于降解及回收PET塑料废弃物提供了可能性。从2005年第一个PET水解酶被报道至今十几年的时间里,这个领域的研究包括机制分析、生化表征和蛋白质工程等,一直局限于几种基准酶。由于缺少有效的专门针对PET水解活性的高通量筛选方法,人们无法更全面地检索各种微生物资源,也无法从大规模的突变体文库中迅速发现活性最高的酶。近年来,人们对常见表征PET水解酶的分析方法进行了各种改良并尝试将它们应用于高通量筛选。本篇综述概括了这个方法学领域的最新进展,并以PET纳米颗粒、紫外/可见光分光光度法、荧光分光光度法以及生物传感器等策略为例子,探讨了高通量PET水解酶筛选的可行性、目前的技术困境以及未来可能取得突破的一些方案。

摘要： 吡咯喹啉醌(pyrroloquinoline quinone,PQQ)是一种红褐色、芳香、三环邻醌的化合物,作为辅因子参与电子传递。在食品、医药和化妆品领域具有重要的应用价值。近几年,微生物发酵法合成PQQ受到了越来越多的关注。该研究以一株具有PQQ生产能力的脱氮生丝微菌(CGMCC 1.12893)为出发菌株,其在摇瓶水平上初始PQQ产量为31.4 mg/L。通过采用常压室温等离子体(atmospheric and room temperature plasma,ARTP)诱变和高通量筛选相结合的方法,筛选得到一株PQQ的高产突变菌株,编号为34,其PQQ产量提高至48.4 mg/L,相比原始菌株提高了54.1%。针对该最优突变菌株,在摇瓶水平上对碳源、氮源、金属离子和维生素等成分进行了优化,PQQ产量提高至105.2 mg/L。最后,在5 L发酵罐上对突变菌株进行验证培养,PQQ产量进一步提高至349.8 mg/L。该研究通过随机诱变筛选得到一株高产PQQ突变株,并通过培养基优化及发酵罐验证培养进一步提高了PQQ产量,研究结果为后续建立相应的发酵过程控制策略奠定了基础。

摘要： 为了快速、高效地筛选出高产米黑根毛霉脂肪酶(RML)的米曲霉菌株,利用常温常压等离子体诱变技术(ARTP)对米曲霉孢子进行诱变,优化了高通量检测RML酶活的双指示剂法,建立了24孔板米曲霉高通量培养体系。通过对诱变后的1200孔(36000~48000个孢子)进行高通量筛选,最终筛选出4株米曲霉高产突变株。经由摇瓶验证,突变株Ⅰ7-D6-7、Ⅱ4-4B-5、Ⅲ3-5C-1、Ⅴ7-6C-3酶活分别达到了265.98、240.90、253.52、293.50 U/mL,比出发菌株的酶活(176.52 U/mL)分别提高了50.68%、36.47%、43.61%、66.27%。

摘要： 文章阐述了研究背景介绍，细菌Ⅲ型分泌系统抑制剂高通量筛选体系的基本原理及其构建，高通量筛选体系的应用等方面内容。

摘要： 本研究以北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense)AK(CpAK)基因为研究对象,选择与其反馈抑制密切相关的氨基酸残基A297进行定点饱和突变,并进行高通量筛选和酶动力学研究,获得酶活力较高的突变体A297K AK,其最大反应速率(Vmax)较未突变的CpAK(WT AK)提高9.55倍,Km值升高,n值降低.酶学性质表征结果显示:其最适反应温度由25°C提高到30°C;最适pH未发生改变,仍为8.0;最适条件下的稳定性由3.5h延长为5h;低浓度苏氨酸、赖氨酸及二者的协同抑制被成功解除.

摘要： 以枯草芽孢杆菌(Bucillus subtilis)TD131为出发菌株,利用常压室温等离子诱变(ARTP)结合96孔板高通量筛选(High-Throughput Screening,HTS)技术,筛选出了4株尿苷(Uridine)生产菌:B.subtilis A219,B.subtilis A260,B.subtilis A566和B.subtilis F126.它们在5L发酵罐上发酵尿苷的最终产量分别为12g/L,14.5g/L,16g/L和18g/L,是出发菌株的3.4倍,4.1倍,4.5倍和5.1倍,具备工业化应用的潜力.建立了用96孔微孔板培养菌体和用酶标仪高通量检测发酵液中嘧啶核苷产量的方法,对工业微生物诱变育种有一定的借鉴作用.将筛选到的尿苷高产菌中的嘧啶核苷操纵子基因进行测序,发现了氨甲酰磷酸合成酶大亚基上的两个突变位点:P1016L和E949*,这两个位点可能是氨甲酰磷酸合成酶变构调控的关键位点.

摘要： 手性β-羟基-α-氨基酸是许多药物合成中的关键中间体,通过对羟基、氨基、羧基的进一步化学反应,能够合成氟苯尼考、万古霉素和屈西多巴等.制备手性β-羟基-α-氨基酸主要是化学不对称合成和消旋体拆分,前者需要在较为苛刻的条件下才能提高产物的立体选择性,后者需要使用大量的金属离子和酸碱试剂.

摘要： 本研究使用较为成熟的微小动物模型评价、筛选抗应激新药，具有安全性好、实验周期短、评价效率高的特点。我们将从已知的天然产物和单体化合物中筛选到有效的抗应激药物，而更加强效的新型抗应激化合物则需要人为设计和合成。将天然产物、单体和药物组合物列入重点考察物质，有助于提高新药发现效率，满足相应患者和人群的抗应激需求，并在国防等领域有重大应用价值。由于控制线虫各种表型的信号通路在高等生物中也同样存在，60%-80%的线虫基因在人类中具有同源基因或相关基因[9, 10]，所以对候选药物进行作用机制的研究成果同样可应用到高等生物中进行更深层次的研究，有助于阐明药物的构效关系，为新型抗应激化合物的设计和合成提供理论基础。

摘要： 本研究使用较为成熟的微小动物模型评价、筛选抗应激新药，具有安全性好、实验周期短、评价效率高的特点。我们将从已知的天然产物和单体化合物中筛选到有效的抗应激药物，而更加强效的新型抗应激化合物则需要人为设计和合成。将天然产物、单体和药物组合物列入重点考察物质，有助于提高新药发现效率，满足相应患者和人群的抗应激需求，并在国防等领域有重大应用价值。由于控制线虫各种表型的信号通路在高等生物中也同样存在，60%-80%的线虫基因在人类中具有同源基因或相关基因[9, 10]，所以对候选药物进行作用机制的研究成果同样可应用到高等生物中进行更深层次的研究，有助于阐明药物的构效关系，为新型抗应激化合物的设计和合成提供理论基础。

摘要： 本研究使用较为成熟的微小动物模型评价、筛选抗应激新药，具有安全性好、实验周期短、评价效率高的特点。我们将从已知的天然产物和单体化合物中筛选到有效的抗应激药物，而更加强效的新型抗应激化合物则需要人为设计和合成。将天然产物、单体和药物组合物列入重点考察物质，有助于提高新药发现效率，满足相应患者和人群的抗应激需求，并在国防等领域有重大应用价值。由于控制线虫各种表型的信号通路在高等生物中也同样存在，60%-80%的线虫基因在人类中具有同源基因或相关基因[9, 10]，所以对候选药物进行作用机制的研究成果同样可应用到高等生物中进行更深层次的研究，有助于阐明药物的构效关系，为新型抗应激化合物的设计和合成提供理论基础。

摘要： 本研究使用较为成熟的微小动物模型评价、筛选抗应激新药，具有安全性好、实验周期短、评价效率高的特点。我们将从已知的天然产物和单体化合物中筛选到有效的抗应激药物，而更加强效的新型抗应激化合物则需要人为设计和合成。将天然产物、单体和药物组合物列入重点考察物质，有助于提高新药发现效率，满足相应患者和人群的抗应激需求，并在国防等领域有重大应用价值。由于控制线虫各种表型的信号通路在高等生物中也同样存在，60%-80%的线虫基因在人类中具有同源基因或相关基因[9, 10]，所以对候选药物进行作用机制的研究成果同样可应用到高等生物中进行更深层次的研究，有助于阐明药物的构效关系，为新型抗应激化合物的设计和合成提供理论基础。

摘要： 文章阐述了发酵工程技术，发酵工程技术生产大宗化学品，发酵工程技术生产食品添加剂，发酵工程技术系统，发酵工程的关键科学技术问题等内容。

摘要： 文章阐述了发酵工程技术，发酵工程技术生产大宗化学品，发酵工程技术生产食品添加剂，发酵工程技术系统，发酵工程的关键科学技术问题等内容。

摘要： 本发明公开了一种用于筛选晶体生成条件的超高通量平台及筛选方法。该平台包括微流控液滴芯片、微液滴收集芯片以及表征‑分析系统；所述微流控液滴芯片用于超高通量生成结晶液滴；所述微液滴收集芯片用于收集所述微流控液滴芯片生成的结晶液滴；所述微液滴收集芯片收集结晶液滴后，由所述表征‑分析系统表征识别所述结晶液滴内的结晶体的形貌，并对表征识别的结晶体形貌进行分析筛选出对应最佳结晶形貌的结晶条件。该超高通量平台为晶体生成条件的快速筛选提供了良好的解决方案。本发明的用于筛选晶体生成条件的筛选方法基于上述的超高通量平台，该筛选方法可快速筛选出优异、稳定的结晶条件，便捷、准确。

摘要： 本发明公开了一种电动转盘系统，该电动转盘系统包括带有驱动电机的底座和设置在底座上的转盘，所述转盘上分布有多个板状卡槽。本发明还提供一种微藻高通量筛选装置和一种微藻的高通量筛选方法，该方法包括，将生长至对数期的微藻接种于微孔板的培养基中，然后将接种微藻的该微孔板固定于上述的电动转盘系统的板状卡槽中，并在转动条件下进行光照培养，测量培养后微孔板中每孔的吸光度，将吸光度换算成对应的微藻细胞干重浓度，以此选择所需的微藻。本发明的方法的筛选结果与利用摇瓶在相同培养条件下的筛选结果一致，而本发明的方法有效地减少了藻种筛选所需的设备和人力投入，同时缩短了藻种筛选工作所需的时间。

摘要： 本发明公开了一种用于筛选治疗器官纤维化的胶原转录抑制剂的高通量筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：克隆人Col1A1、Col1A2、Col3A1启动子‑2000‑100区域，单独或联合插入pGL3‑basic报告基因载体，经转化DH5α菌和质粒提取得到用于转染的质粒；将得到的质粒分别与内参pRL‑TK质粒转染成纤维细胞，后加入TGF‑β1激活；或同时加入TGFβR抑制剂；激活后按照荧光素酶报告基因检测试剂盒进行处理，酶标仪读取化学发光数据，得出对TGF‑β1诱导的胶原合成敏感的质粒，以上结果证实了该种筛选方法的实用性。还公开了利用该方法在测定抑制I/III型胶原转录药物的药效定量分析中的应用。

摘要： 本发明公开了一组不同启动子介导的蛋白酶高通量筛选载体及筛选方法。本发明通过在pESD载体上插入不同转录强度的启动子GALX，构建了GALX–pESD‑GAL1/GAL10‑Aga2‑FLAG‑HA重组质粒，在相应的启动子后插入底物序列与酶突变体库，利用荧光标记技术和流式细胞仪检测细胞表面展示的蛋白，根据细胞表面荧光的强弱，从而分析底物与酶的不同比例下底物的酶切情况。这种方法在蛋白酶进化过程中，可以控制酶与底物的浓度在1:2到1:100之间，利用启动子转录的强弱来逐步提高酶活，最终获得高活性的蛋白酶突变体。

摘要： 本发明公开了一种电动转盘系统，该电动转盘系统包括带有驱动电机的底座和设置在底座上的转盘，所述转盘上分布有多个板状卡槽。本发明还提供一种微藻高通量筛选装置和一种微藻的高通量筛选方法，该方法包括，将生长至对数期的微藻接种于微孔板的培养基中，然后将接种微藻的该微孔板固定于上述的电动转盘系统的板状卡槽中，并在转动条件下进行光照培养，测量培养后微孔板中每孔的吸光度，将吸光度换算成对应的微藻细胞干重浓度，以此选择所需的微藻。本发明的方法的筛选结果与利用摇瓶在相同培养条件下的筛选结果一致，而本发明的方法有效地减少了藻种筛选所需的设备和人力投入，同时缩短了藻种筛选工作所需的时间。

摘要： 本发明公开了一种基于细胞内蛋白激酶C激活状态筛选药物的方法及高通量筛选装置，该方法包括以下步骤：首先将细胞置于药物筛选芯片上，使细胞直接贴于药物筛选芯片表面后，置于药物筛选装置中，调整偏振光的入射角度为发生表面等离子共振时的角度，此时检测单元中反射光强度为最低；将待筛选药物依次加入上述生物芯片表面，进行检测单元中反射光的强度变化情况的检测，若待筛选药物中存在Gq蛋白偶联受体﹑部分酪氨酸激酶受体或蛋白激酶C等的激动剂，则细胞区域反射进入检测单元的反射光的强度增强。本发明实验准确率更高，先导化合物无需标记，细胞也无需荧光等染色试剂处理，具有操作简便、过程简单、检测时间短、检测成本低等优势。

摘要： 本发明属于分子生物学和药理学领域，公开了一种用于筛选FXR激动剂的高通量筛选模型，具体公开了一种FXR反应元件，包括hSHP_FXRE、hBSEP_FXRE和hMDR2_FXRE，所述hSHP_FXRE的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述hBSEP_FXRE的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述hMDR2_FXR的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。与传统含有多个顺式作用元件IR1(如3xIR1)相比，本发明提供的FXR反应元件，可极大提高使用传统顺式作用元件系统的检测灵敏度。

摘要： 本发明公开了一种用于筛选影响胶原稳定性化合物的高通量筛选方法，基于荧光共振能量转移或报告基因片段互补，通过质粒共转染细胞后，培养基中加入不同浓度的P4HA1抑制剂s4682，加药24h后酶标仪检测FRET，或荧光数据或化学发光，FRET、Venus片段互补和Gluc片段互补测试测得s4682抑制胶原链分子间相互作用的IC50，以上结果证实了该筛选方法的实用性。还公开了一种利用该方法在测定降低胶原三股螺旋稳定性药物的药效定量分析中的应用以及在测定增加胶原三股螺旋稳定性化合物的定量分析中的应用。

摘要： 本发明公开了一种用于筛选治疗器官纤维化的胶原转录抑制剂的高通量筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：克隆人Col1A1、Col1A2、Col3A1启动子‑2000‑100区域，单独或联合插入pGL3‑basic报告基因载体，经转化DH5α菌和质粒提取得到用于转染的质粒；将得到的质粒分别与内参pRL‑TK质粒转染成纤维细胞，后加入TGF‑β1激活；或同时加入TGFβR抑制剂；激活后按照荧光素酶报告基因检测试剂盒进行处理，酶标仪读取化学发光数据，得出对TGF‑β1诱导的胶原合成敏感的质粒，以上结果证实了该种筛选方法的实用性。还公开了利用该方法在测定抑制I/III型胶原转录药物的药效定量分析中的应用。

摘要： 本发明公开了一种高通量筛选酮类化合物的检测方法及其在酶筛选中的应用。本发明提供了5‑甲氧基‑2‑氨基苯甲酰胺肟的应用，为如下(a1)‑(a4)中的至少一种：(a1)酮类化合物含量的检测；(a2)酶活性的检测；(a3)高活性酶的筛选；(a4)酶的定向进化；所述酶为可催化生成酮类化合物或消耗酮类化合物的酶。本发明为酮类化合物的检测提供高通量方法，且底物范围广，操作简便，反应灵敏，检测准确，对设备要求低，通用性强，能够快速检测水相体系和非水相体系中的酮类物质含量；并可与催化生成酮或消耗酮的酶偶联，建立酶活力高通量筛选方法。本发明对于酮类化合物的筛选、高效挖掘新酶或定向进化已知酶具有重要意义。