dsRNA

摘要： The specificity of the double-stranded RNA(dsRNA) used in the RNA interference(RNAi) technique is crucial for the success of sequence-specific gene silencing. Currently, RNAi-mediated insect control is a trending research topic.However, the off-target effects of the dsRNA in RNAi are a major concern. In this study, the ds Hvβ’COPI(coat protein complex I, β’ subunit)-treated and untreated transcriptomes of the 28-spotted potato lady beetle(Henosepilachna vigintioctopunctata) were compared to understand its off-target gene silencing effects. The RNA-seq results revealed that 63 and 44 differentially expressed genes(DEGs) were upregulated and downregulated, respectively, in the ds Hvβ’COPI treated group as compared with the control. Validation of the differential expressions of some selected DEGs via reverse transcription-quantitative PCR(RT-qPCR) analysis confirmed the reliability of the transcriptome analysis results. Further downstream analysis revealed that there were no genes homologous with Hvβ’COPI in H. vigintioctopunctata. Additionally,no genes with a >11 bp continuous match with ds Hvβ’COPI were found in the H. vigintioctopunctata transcriptome. Six genes(Hvcitron, Hvhelicase, Hvtransposase, Hvserine, Hvdynein, and Hv E3 ubiquitin) were selected to examine the offtarget activity of ds Hvβ’COPI based on their potential involvement in various H. vigintioctopunctata metabolic pathways.The severity of silencing these six off-target genes was evaluated by employing RNAi. The RNAi results confirmed the downregulation of the expression of all six genes, although there was no significant lethality. The findings of this study will be helpful in the risk analysis of future RNAi-mediated pest control experiments.

摘要： 随着昆虫分子生物学技术的蓬勃发展,RNA干扰(RNAi)作为21世纪以来的变革性技术,通过特异性抑制靶基因转录后水平的表达,在昆虫基因功能研究方面被广泛应用.由于沉默重要基因的表达会导致某些昆虫的死亡或行为缺陷,故该技术被认为是一种潜在的害虫防治策略,在控制、研究甚至保护昆虫方面具有巨大潜力,目前已被广泛应用于半翅目、直翅目、双翅目等昆虫.RNAi是昆虫学研究和害虫控制潜在应用的流行和重要的反向遗传学策略.从RNAi技术的原理、导入方法、效率影响因素及在农业害虫中的应用研究实例等4方面进行了综述,并对其防控应用和发展前景进行了展望.

摘要： [目的]本研究旨在构建用于小菜蛾Plutella xylostella蛹期特异表达基因Br-Z2/3 dsRNA合成的体外原核表达系统,研究RNAi抑制Br-Z2/3基因对小菜蛾Br-Z2/3和细胞凋亡基因表达及化蛹的影响.[方法]构建小菜蛾L4440-Br-Z2/3重组载体,转化大肠杆菌Escherichia coli HT115感受态细胞,经IPTG诱导大量获得Br-Z2/3 dsRNA,显微注射Br-Z2/3 dsRNA至小菜蛾4龄幼虫进行RNAi;qPCR检测干扰Br-Z2/3基因12和24 h后小菜蛾4龄幼虫Br-Z2/3及其下游细胞凋亡基因reaper,caspase-9和Gadd45g的表达量;观察并统计Br-Z2/3 RNAi后小菜蛾4龄幼虫的化蛹率、平均化蛹时间、蛹畸形率和幼虫死亡率.[结果]成功实现了 Br-Z2/3 dsRNA的原核表达.qPCR结果表明,RNAi干扰Br-Z2/3后,小菜蛾4龄幼虫Br-Z2/3基因和相关联的细胞凋亡基因reaper表达量显著下降,但caspase-9 和 Gadd45g表达量显著上升.注射Br-Z2/3 dsRNA的处理组,化蛹率显著低于对照组,且化蛹高峰期推迟,幼虫死亡率显著高于对照组且畸形蛹率增加.[结论]本研究成功构建了用于小菜蛾Br-Z2/3基因dsRNA合成的体外原核表达系统,利用显微注射法对Br-Z2/3进行RNA干扰,证明Br-Z2/3是调控小菜蛾化蛹的关键基因.

摘要： [目的]筛选高效靶向降解烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus,TMV)的dsRNA,实现其大量制备,并探究其作用机制.[方法]以TMV编码的CP、MP、RdRP功能基因为靶序列,体外转录合成相应的dsRNA,浸润本氏烟(Nicotiana benthamiana),24 h后接种TMV,于接毒后2、3 d取样提取总RNA和蛋白质,以CP基因mRNA水平和蛋白水平为指标,结合TMV病毒生物学症状,综合评价各dsRNA对TMV的抑制效果.同时结合侵染性克隆TMV-30B在本氏烟烟株上的荧光表达现象和TMV在三生烟(Nicot iana tabacum var.Samsun NN)上的过敏性坏死反应(hypersensitive necrosis reaction),通过比较TMV基因组上6个靶序列相对应的dsRNA,筛选出高效抑制TMV的dsRNA片段.为了获取大量的dsRNA,将dsRNA对应的基因片段插入到原核表达载体L4440的双T7启动子之间,转化至RNase Ⅲ缺陷型大肠杆菌(Escherichia coli)HT115(DE3)中,并对原核表达制备的dsRNA喷施烟草后生成的siRNA进行深度测序,比较外源施用dsRNA后,对TMV侵染的small RNA表达特征和富集带的影响.[结果]筛选出高效影响TMVCP基因表达的dsRNA RdRP1461-1774,并构建了可诱导形成目的dsRNA的原核表达载体L4440-dsRdRP1461-1774,可在DE3中大量制备RdRP1461-1774的dsRNA,菌液中提取的dsRNA喷施于烟草上对TMV的防治效果显著.TMV-30B侵染本氏烟时荧光数量减少,并能够延长叶片萎蔫时间,在三生烟上施用时叶片枯斑数量明显减少.小RNA测序结果显示TMV侵染引起的RNAi过程中正义链和反义链以大致相等的频率产生siRNA,而外源性dsRNA的浸润会引起靶向区域siRNA的富集,siRNA反义链累积量骤增,对应的正义链累积量骤减,外源dsRNA的施用能够引起siRNA表达丰度的变化.[结论]通过比较dsRNA介导植物靶向抗TMV侵染的效果来筛选抗烟草花叶病毒的dsRNA序列,最终选定TMV RdRP基因上一段长313 bp的高效作用片段,该片段dsRNA能够高效与靶基因结合,降低染病植株烟草花叶病毒的表达量.同时构建了RdRP1461-1774基因的dsRNA原核表达系统,实现其低成本的高效量产,为后续dsRNA在植物病毒方面的防治应用打下了基础.

摘要： [目的]筛选针对灰飞虱Laodelphax striatellus RNAi的dsRNA高效纳米递送载体.[方法]使用壳聚糖、碳量子点(carbon quantum dot,CQD)和lipofectamine 2000作为代表性纳米粒子,分别与dsRNA进行混合,形成稳定的3种不同复合颗粒,利用光谱法检测其dsRNA装载率.以灰飞虱膜结合型海藻糖酶基因LsStre为靶标基因来测试3种纳米粒子的RNAi效率.用不同纳米粒子包裹的dsLsStre喂食后,通过荧光实时定量PCR(qPCR)检测喂食后2 d灰飞虱2龄若虫中LsStre mRNA表达水平,并检测和计算灰飞虱2龄若虫在6 d内的校正死亡率,以裸dsLsStre引起的2龄若虫死亡率为对照,评价3种纳米载体对LsStre的RNAi增效作用.[结果]3种纳米载体均能负载dsEgfp,且这3种纳米载体复合dsEgfp的效率均在95％以上.3种纳米材料对灰飞虱2龄若虫的毒性均较弱.同未用纳米粒子包裹的裸dsLsStre喂食组(对LsStre表达量的抑制率为46％)相比,壳聚糖和CQD能够显著提高LsStre的RNAi效率(对LsStre表达量的抑制率分别为78％和84％),而lipofectamine 2000不能显著提高LsStre的RNAi效率(抑制率为52％).壳聚糖和CQD可以有效提高喂食dsLsStre对灰飞虱2龄若虫的致死效应,在连续喂食6 d后,灰飞虱2龄若虫的校正死亡率分别达到76％和82％,与直接用裸dsLsStre处理的对照组校正死亡率(35％)相比,增效系数分别达到2.17和2.34,lipofectamine 2000的增效能力最弱,其与dsLsStre的复合颗粒处理引起灰飞虱2龄若虫死亡率为38％,增效系数为1.09.[结论]壳聚糖和CQD纳米载体能够显著提高灰飞虱对于喂食dsRNA的敏感性,而lipofectamine 2000的RNAi增效作用较弱.研究结果有助于评价纳米载体在灰飞虱RNAi中的增效作用,为进一步开发和筛选有效的RNAi纳米载体,实现害虫绿色防控,提供了理论依据和应用策略.

摘要： [目的]苹果斑点落叶病在我国各苹果主产区均有发生,给苹果产业造成了严重的经济损失.苹果斑点落叶病是由链格孢苹果专化型(Alternaria alternata f.sp.mali)侵染引起的一种气传病害.本研究旨在探明我国苹果斑点落叶病菌携带dsRNA的情况,为田间防治斑点落叶病提供新的生防资源,并为病毒的多样性以及进化研究提供新的认识.[方法]从全国8个省份采集有典型症状的组织样本,通过组织分离和单孢分离法获得纯培养;通过dsRNA的提取及凝胶电泳明确我国苹果斑点落叶病菌携带dsRNA的情况;通过菌株培养特性、菌丝生长速率、在果实及叶片上的致病力测定揭示携带dsRNA病原菌的生物学性状;通过高通量测序技术、分子克隆技术对QY-2菌株携带的dsRNA病毒进行全基因组序列、基因组结构和系统进化分析.[结果]自我国苹果产区获得102株苹果斑点落叶病菌菌株的纯培养,通过dsRNA的提取及凝胶电泳明确了5个菌株带有明显的dsRNA条带,携带的dsRNA分为4种类型,类型Ⅰ(菌株YT-3-7)dsRNA在8、2.5和1.5 kb左右;类型Ⅱ(菌株SJZ-4)dsRNA在8 kb左右;类型Ⅲ(菌株QY-2)dsRNA在3和0.8kb左右;类型Ⅳ(菌株CL-2-6和SQ-1-1)dsRNA在2.5和1.5 kb左右.含有dsRNA的菌株培养性状多样,菌落特征、生长速率与dsRNA携带与否及类型没有明显的关系,含有dsRNA的菌株大多属于弱致病力菌株.QY-2在叶片和果实上的致病力均最弱,确定其携带的dsRNA病毒基因组包括5个dsRNA片段,分别为dsRNA1-dsRNA5,片段大小依次为3665、3054、2824、2819、831 nt,提交至GenBank,登录号分别为MK672910、MK672913、MK672912、MK672911、MK836314.编码蛋白的分子量依次为124、83、84、83、13 kD.经系统进化关系分析,与Alternaria alternata chrysovirus 1遗传关系最近,确定其为产黄青霉病毒科(Chrysoviridae)、β产黄青霉病毒属(Betachrysovirus)的Alternaria alternata chrysovirus,暂定命名为Alternaria alternata chrysovirus 2(AaCV2).[结论]我国苹果斑点落叶病菌携带dsRNA群体多样,dsRNA的有无及类型与寄主病原菌培养性状没有明显相关性,携带dsRNA的菌株多为弱致病力菌株,致病力最低的QY-2菌株携带AaCV2.该菌株的弱致病力可能具有潜在的应用价值,可为苹果斑点落叶病提供新的生防资源.

摘要： 旨在揭示稻田施用转基因微生物制造农药(dsRNA)的环境稳定性,以便为dsRNA的高效应用和安全评估提供理论依据,南农大研究人员以绿色荧光蛋白基因EGFP为模板合成dsRNA,利用点滴法处理稻苗叶片,利用定量添加处理稻田水,定时取样测定观察。

摘要： 主要综述了转录后基因沉默(PTGS)的发现、定义、机制、与植物抗病毒的关系及利用转录后基因沉默防治植物病毒病研究进展.

摘要： 主要综述了转录后基因沉默(PTGS)的发现、定义、机制、与植物抗病毒的关系及利用转录后基因沉默防治植物病毒病研究进展.

摘要： 主要综述了转录后基因沉默(PTGS)的发现、定义、机制、与植物抗病毒的关系及利用转录后基因沉默防治植物病毒病研究进展.

摘要： 综述了食用菌病毒的生物学特性及其分子生物学研究进展。自20世纪70年代末发展起来的dsRNA技术在植物和真菌病毒的检测和分子生物学研究中的应用十分广泛,也已开始用于食用菌病毒的检测和分子生物学研究。认为简便实用的dsRNA技术将会在食用菌病毒的检测和分子生物学研究尤其是在脱毒菌种的制备和检测方面起到重要作用。

摘要： 综述了食用菌病毒的生物学特性及其分子生物学研究进展。自20世纪70年代末发展起来的dsRNA技术在植物和真菌病毒的检测和分子生物学研究中的应用十分广泛,也已开始用于食用菌病毒的检测和分子生物学研究。认为简便实用的dsRNA技术将会在食用菌病毒的检测和分子生物学研究尤其是在脱毒菌种的制备和检测方面起到重要作用。

摘要： 综述了食用菌病毒的生物学特性及其分子生物学研究进展。自20世纪70年代末发展起来的dsRNA技术在植物和真菌病毒的检测和分子生物学研究中的应用十分广泛,也已开始用于食用菌病毒的检测和分子生物学研究。认为简便实用的dsRNA技术将会在食用菌病毒的检测和分子生物学研究尤其是在脱毒菌种的制备和检测方面起到重要作用。

摘要： 综述了食用菌病毒的生物学特性及其分子生物学研究进展。自20世纪70年代末发展起来的dsRNA技术在植物和真菌病毒的检测和分子生物学研究中的应用十分广泛,也已开始用于食用菌病毒的检测和分子生物学研究。认为简便实用的dsRNA技术将会在食用菌病毒的检测和分子生物学研究尤其是在脱毒菌种的制备和检测方面起到重要作用。

摘要： 综述了食用菌病毒的生物学特性及其分子生物学研究进展。自20世纪70年代末发展起来的dsRNA技术在植物和真菌病毒的检测和分子生物学研究中的应用十分广泛,也已开始用于食用菌病毒的检测和分子生物学研究。认为简便实用的dsRNA技术将会在食用菌病毒的检测和分子生物学研究尤其是在脱毒菌种的制备和检测方面起到重要作用。

摘要： 本发明提供了一种Gustavus基因及其应用、由其合成的dsRNA及dsRNA的制备方法与应用，Gustavus基因的DNA序列如SEQ ID NO.1所示，dsRNA的核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示。dsRNA的制备方法：以Gustavus基因的DNA序列为模板，合成Gustavus基因片段；Gustavus基因片段作为模板，设计含有T7启动子序列的引物对；通过PCR扩增得到所述dsRNA合成模板；体外合成dsRNA。Gustavus基因是与昆虫繁殖相关的正向调控因子。通过dsRNA技术，使得蚜虫生殖细胞在发育过程中出现障碍，无法形成正常的胚胎从而达到降低蚜虫种群数量的目的。

摘要： 本发明涉及一种生物体或组织中dsRNA及提取该dsRNA的方法。该方法包括预处理、离心获取上清液的步骤，将上清液进行层析并分段洗脱的步骤，以及收集洗脱液进行后处理的步骤。本发明结合有机试剂处理和纤维素柱层析，先对生物体或组织进行处理，促使其破碎，以释放核酸物质至液相中；再利有纤维素柱层析中填料对液相中浓度核酸物质进行可逆性吸附，通过分段洗脱，能够有效分离dsRNA与其他核酸物质，尤其能够显著降低DNA降解物质的干扰，提高最终产品dsRNA的纯度。

摘要： 本发明提供了一种Gustavus基因及其应用、由其合成的dsRNA及dsRNA的制备方法与应用，Gustavus基因的DNA序列如SEQ ID NO.1所示，dsRNA的核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示。dsRNA的制备方法：以Gustavus基因的DNA序列为模板，合成Gustavus基因片段；Gustavus基因片段作为模板，设计含有T7启动子序列的引物对；通过PCR扩增得到所述dsRNA合成模板；体外合成dsRNA。Gustavus基因是与昆虫繁殖相关的正向调控因子。通过dsRNA技术，使得蚜虫生殖细胞在发育过程中出现障碍，无法形成正常的胚胎从而达到降低蚜虫种群数量的目的。

摘要： 本发明公开了筛选用于鉴别能破坏dsRNA结合蛋白或蛋白复合物与dsRNA结合的化合物的方法,还公开了用这种化合物治疗病毒感染的方法。

摘要： 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于飞蝗zen基因片段合成的dsRNA及其在提高丁醚脲防治飞蝗效果中的应用。一种飞蝗zen基因，该基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示的序列。一种两端均融合有T7启动子的所述飞蝗zen基因片段，其核苷酸序列为SEQ ID NO:7所示的序列。本发明将一种基于飞蝗zen基因片段合成的dsRNA，用显微操作系统将该dsRNA注射入飞蝗新生卵中，可检测到飞蝗zen基因的mRNA表达水平下降，同时将丁醚脲对飞蝗卵的致死率提高至12.78倍。

摘要： 本发明属于生物技术领域，具体涉及蟋蟀CDA1和CDA2基因的dsRNA合成方法及其应用。蟋蟀CDA1和CDA2基因的获取：通过巢式PCR获得目的基因，将目的基因与T载体连接，转入感受态细胞中，进行蓝白斑筛选，挑取白斑到LB液体培养基中，进行菌液PCR，有目的条带的菌液送测序。蟋蟀CDA1和CDA2基因合成的dsRNA以及在害虫防治中的应用：设计带有T7启动子的上游引物和下游引物，通过PCR扩增，切胶回收获得合双链RNA的模板，体外转录合成dsRNA，蟋蟀注射dsRNA后，出现死亡，大量延迟发育表型，其卵的孵化率也明显降低的现象。

摘要： 本发明公开新型dsRNA聚合物纳米载体的制备方法，涉及农药纳米载体的制备技术领域，是基于传统聚合物纳米载体进入虫害细胞后无法及时、有效地将dsRNA进行释放出来的问题提出的。本发明还提供上述新型dsRNA聚合物纳米载体的制备方法制得的纳米载体，纳米载体的结构式为：本发明还提供上述新型dsRNA聚合物纳米载体的制备方法制得的纳米载体在虫害防治领域的应用。本发明所构筑的荧光纳米载体很好的解决了传统聚合物纳米载体进入虫害细胞后无法及时、有效地将dsRNA进行释放出来的问题，由于生物体内都存在着大量ATP，而本发明的荧光纳米载体碰到ATP就会破裂开来，从而将包裹的物质释放出来。

摘要： 本发明公开了青虾Legumain‑like基因及其dsRNA的应用，属于生物技术领域。本发明提供了一种青虾Legumain‑like基因及其dsRNA的应用，包括青虾Legumain‑like基因、基因片段及其dsRNA和dsRNA在抑制青虾卵巢发育中的应用。首先通过基因克隆获得Legumain‑like的全序列，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1，氨基酸序列为SEQ ID NO.2。以全序列为模板设计RNA干扰引物，获得干扰基因片段SEQ ID NO.3。再由引物合成dsRNA。将dsRNA、dsGFP注射进雌性青虾的围心腔进行干扰，通过检测发现有效地抑制了雌性青虾卵巢的发育。

摘要： 本发明涉及生物技术领域，具体公开了甘薯小象甲的CforOBP36基因、编码蛋白及其dsRNA和应用，CforOBP36基因核苷酸序列为CforOBP36 ID No.1，该基因在维持甘薯小象甲正常的嗅觉识别过程中发挥重要功能，为甘薯小象甲防治提供了新的靶标位点；根据CforOBP36基因合成dsRNA，导入甘薯小象甲体内，抑制甘薯小象甲CforOBP36基因表达，使甘薯小象甲雄虫识别性信息素的能力下降。本发明的靶标基因核酸序列与其他生物同源性较低的特点，可以在核酸水平上进行RNA干扰，避免了由于蛋白质结构保守对非靶标生物的伤害，有望在实现防治害虫行为的同时，充分发挥生态防治的功能。

摘要： 本发明公开了一种靶向蚜虫AK、SOD和CHS基因并可致死蚜虫的dsRNA药剂的制备、筛选及其应用，所述蚜虫AK、SOD和CHS基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5，所述靶向蚜虫AK、SOD和CHS基因并可致死蚜虫的dsRNA的核苷酸序列为SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6，本发明开发了一种可筛选高效致死蚜虫的dsRNA的“饲养浸泡法”。本发明还提供了一种dsRNA复配药剂的制备方法，该药剂通过诱导蚜虫靶标基因AK、SOD和CHS的沉默，导致橘蚜出现高致死率，从而实现对柑橘蚜虫的防治，减少柑橘衰退病的传播。