Dot－ELISA

摘要： 目的建立一种猪链球菌的快速、简便检测方法。方法根据猪链球菌2型强毒株05ZYH33组氨酸三联体蛋白HtpsC蛋白基因序列设计特异性引物,将HtpsC蛋白基因克隆至原核表达载体pET-30a并转化至大肠杆菌BL21(DE3),经0.2 mmol/L IPTG、15°C条件下诱导表达HtpsC蛋白。经Ni-IDA纯化后免疫新西兰白兔获得抗血清,通过亲和层析纯化制备Anti-HtpsC多克隆抗体。在此基础上,建立检测猪链球菌的斑点酶联免疫吸附检验法(Dot-ELISA),进一步优化了检测条件,并对该方法的特异性和敏感性进行评价。结果通过原核表达成功制备了HtpsC蛋白。Western blot结果显示,制备的Anti-HtpsC多克隆抗体可特异性结合HtpsC蛋白。优化的最佳多抗使用浓度为2.5μg/mL,最佳酶标二抗稀释倍数为1∶3000。特异性试验结果表明,含HtpsC蛋白基因的多种血清型猪链球菌均可呈现清晰的黄褐色斑点,但不含该蛋白基因的9型猪链球菌除外。而其他对照菌株:大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、化脓性链球菌、无乳链球菌和粪肠球菌均无斑点出现。灵敏度试验结果表明,该方法的检测限为1×10^(6)CFU/mL。结论本研究建立的Dot-ELISA方法特异性强,灵敏度良好,可用于检测多种血清型猪链球菌。

摘要： 为建立基于猪瘟病毒E2基因主要抗原区表达产物的猪瘟抗体斑点杂交ELISA方法,应用RT-PCR方法扩增了猪瘟病毒E2基因的主要抗原区(dE2),经EcoR I、Xho I双酶切,与经同样双酶切的原核表达载体pET-28a (+)连接,加入适量IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blotting分析结果表明,成功表达的重组蛋白分子量约32.4 KDa,能与CSFV阳性血清特异性结合,为CSFV抗体检测提供了有效工具。

摘要： [目的]分析日本血吸虫可溶性虫卵抗原的特异组分,为建立牛血吸虫病免疫学诊断方法提供数据支持.[方法]用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、免疫印迹法(Western-blot)、葡聚糖凝胶层析和斑点酶联免疫吸附试验(Dot-ELISA),对日本血吸虫可溶性虫卵抗原进行了分离、鉴定.[结果]SDS-PAGE分离出10条蛋白条带,依次为100、80、60、55、45、28、27、17、15和13 KDa的小分子量蛋白;采用阳性病牛血清进行Western-blot,共鉴定出有3条特异带,分子量分别为50、28、17 KDa,28和17KDa条带较为明显,而50KDa条带较弱;葡聚糖凝胶层析分离出2个蛋白质高峰,即大分子量蛋白组分峰(I峰)和小分子量蛋白组分峰(Ⅱ峰);再经Dot-ELISA鉴定表明,Ⅱ峰中高速离心后的上清蛋白是可用于牛血吸虫病诊断的特异性抗原.[结论]葡聚糖凝胶层析分离出的Ⅱ峰蛋白再经过高速离心后,其上清蛋白是能够用于牛日本血吸虫病诊断的特异性天然蛋白.

摘要： 为建立南方菜豆花叶病毒(southern bean mosaic virus,SBMV)的快速、简便、高通量检测技术,加强该病毒的口岸检验检疫,以提纯的SBMV粒子为免疫原免疫BALB/C小鼠,利用杂交瘤技术获得3株杂交瘤细胞株19C3、19H9和20G4,其分泌的SBMV腹水单抗效价均达到10-7,且3个单抗与感染SBMV大豆叶片组织粗提液有强烈的特异性免疫反应,而不与感染南方豇豆花叶病毒(southern cowpea mosaic virus,SCPMV)的豇豆、健康的大豆、毛豆、豌豆、蚕豆和菜豆叶片组织粗提液发生免疫反应.以制备的单抗为核心,建立了检测植物中SBMV的ACP-ELISA和dot-ELISA两种血清学方法.3个单抗中19H9单抗的检测灵敏度最高,以其建立的ACP-ELISA和dot-ELISA方法检测大豆病叶粗提液的灵敏度分别达到1∶163 840和1∶10 240稀释浓度.利用建立的dot-ELISA方法可从上海口岸截获的大豆种子中检测出SBMV,且该检测结果得到RT-PCR方法验证.表明制备的SBMV单抗及建立的SBMV血清学检测技术可有效用于我国SBMV的口岸检验检疫.

摘要： 为快速检测猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)抗体,本研究以原核表达系统串联表达的含有TGEV S蛋白抗原表位C的重组蛋白r-(C1C2)6为包被抗原建立TGEV血清抗体的Dot-ELISA检测方法.经反应条件优化结果显示,抗原最适包被量为62.5 ng/点;血清最佳工作浓度和工作时间分别为1∶80和45 min;羊抗猪IgG-HRP最佳工作浓度和工作时间分别为1∶800和45 min;最适封闭条件分别为5％脱脂乳37°C,45 min;血清和酶标抗体最适反应温度均为37°C;最佳显色时间7.5 min.结果显示该方法与猪轮状病毒和猪流行性腹泻病毒阳性血清无交叉反应,表明其具有良好的特异性.该方法对TGEV阳性血清最低检测限为1∶1 280.采用建立的Dot-ELISA对27份临床猪血清样品进行检测,结果显示Dot-ELISA与TGEV/PRCV抗体检测试剂盒检测结果的符合率为92.6％.本研究建立的Dot-ELISA检测方法简便、快速、灵敏、特异,适合用于TGE快速诊断.

摘要： 以制备的抗南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV)单抗2C2为核心,建立了检测水稻叶片和白背飞虱虫中SRBSDV的dot-ELISA试剂盒.试剂盒的灵敏度分析表明,当SRBSDV感染病叶稀释到1:10240倍(w/v,g/mL)、单头携毒白背飞虱稀释到1:51200倍(头/μL)时仍能检测到SRBSDV.建立的试剂盒检测感染SRBSDV的水稻和携毒白背飞虱呈阳性反应,而检测感染水稻黑条矮缩病毒、水稻矮缩病毒、水稻条纹病毒、水稻瘤矮病毒、水稻条纹花叶病毒、水稻锯齿矮缩病毒的病叶和健康水稻及非携毒白背飞虱呈阴性反应.试剂盒的田间样品检测结果与RT-PCR方法的检测结果的符合率达到100％,核酸测序和序列比对结果发现RT-PCR检测阳性的样品确实感染SRBSDV.试验结果表明,建立的检测试剂盒能准确、有效地检测田间白背飞虱及水稻样品中的SRBSDV,可为我国南方水稻黑条矮缩病的检测和诊断、预测预警及科学防控提供技术服务.

摘要： 为建立快速有效的气肿疽检测方法,制备气肿疽梭菌多克隆抗体.以斑点酶联免疫吸附方法,筛选出最佳工作条件,确定抗体最佳稀释度为1:1024;可检测到最低菌体抗原量为3.125μg,最低分泌抗原量为1.89μg;最适酶标二抗浓度为1:4000.应用该方法检测20份死于气肿疽的豚鼠脏器,其中肝脏、脾脏、心脏、肺脏、肾脏、肌肉阳性率分别为95％、95％、90％、90％、85％和90％;与琼脂免疫扩散试验(AGID)法相比,灵敏度是其40倍.该试验成功建立了检测气肿疽病原体的Dot-ELISA方法.

摘要： 本研究选用硝酸纤维素膜作固相载体,以出现明显清晰斑点者判为阳性结果,成功建立了检测致病性副溶血弧菌耐热直接溶血素(direct heat hemolysin,TDH)的斑点酶联免疫吸附试验(Dot-ELISA)方法。根据棋盘试验,确定免疫血清最佳工作浓度为1:100,酶标二抗最佳工作浓度为1:1000。特异性检测结果表明,TDH阳性的副溶血弧菌可以呈现明显清晰斑点,而不能产生TDH的副溶血弧菌及其他对照菌(如嗜水气单胞菌、大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌)均无斑点显示。该方法与PCR方法的符合率为82.5%。本研究所建立的Dot-ELISA检测方法简便、快速,特异性和敏感性较高,适合基层和现场的初步筛选。

摘要： 用提纯的IgG包被酶标板,建立了检测DHV的单抗AC-ELISA,确定IgG的最佳包被浓度为1:80,单抗的最佳稀释度为1:100(效价1:102;400),经比较表明该IgG包被法要优于单抗包被.同时还建立了检测DHV的单抗Dot-ELISA,确定最佳点样量为2.723g/dot,最小检出量为1.362g/dot,单抗最佳稀释度为1:400(效价1:102,400).两种方法均能特异地从病料中检出DHV,对接毒后的死亡胚各部分检测结果表明,胚肝中病毒含量最高,而尿囊液中最低.对125份人工发病鸭肝脏病料、47份可疑DVH肝脏病料和10份可疑DHV分离物的检测符合率为95.1％,表明所建立的单抗AC-ELISA和单抗Dot-ELISA应用效果良好,操作简单、方便,结果特异性强,敏感性高,比较适用于疾病诊断中大批病毒样品的检测。

摘要： 用提纯的IgG包被酶标板,建立了检测DHV的单抗AC-ELISA,确定IgG的最佳包被浓度为1:80,单抗的最佳稀释度为1:100(效价1:102;400),经比较表明该IgG包被法要优于单抗包被.同时还建立了检测DHV的单抗Dot-ELISA,确定最佳点样量为2.723g/dot,最小检出量为1.362g/dot,单抗最佳稀释度为1:400(效价1:102,400).两种方法均能特异地从病料中检出DHV,对接毒后的死亡胚各部分检测结果表明,胚肝中病毒含量最高,而尿囊液中最低.对125份人工发病鸭肝脏病料、47份可疑DVH肝脏病料和10份可疑DHV分离物的检测符合率为95.1％,表明所建立的单抗AC-ELISA和单抗Dot-ELISA应用效果良好,操作简单、方便,结果特异性强,敏感性高,比较适用于疾病诊断中大批病毒样品的检测。

摘要： 用提纯的IgG包被酶标板,建立了检测DHV的单抗AC-ELISA,确定IgG的最佳包被浓度为1:80,单抗的最佳稀释度为1:100(效价1:102;400),经比较表明该IgG包被法要优于单抗包被.同时还建立了检测DHV的单抗Dot-ELISA,确定最佳点样量为2.723g/dot,最小检出量为1.362g/dot,单抗最佳稀释度为1:400(效价1:102,400).两种方法均能特异地从病料中检出DHV,对接毒后的死亡胚各部分检测结果表明,胚肝中病毒含量最高,而尿囊液中最低.对125份人工发病鸭肝脏病料、47份可疑DVH肝脏病料和10份可疑DHV分离物的检测符合率为95.1％,表明所建立的单抗AC-ELISA和单抗Dot-ELISA应用效果良好,操作简单、方便,结果特异性强,敏感性高,比较适用于疾病诊断中大批病毒样品的检测。

摘要： 用提纯的IgG包被酶标板,建立了检测DHV的单抗AC-ELISA,确定IgG的最佳包被浓度为1:80,单抗的最佳稀释度为1:100(效价1:102;400),经比较表明该IgG包被法要优于单抗包被.同时还建立了检测DHV的单抗Dot-ELISA,确定最佳点样量为2.723g/dot,最小检出量为1.362g/dot,单抗最佳稀释度为1:400(效价1:102,400).两种方法均能特异地从病料中检出DHV,对接毒后的死亡胚各部分检测结果表明,胚肝中病毒含量最高,而尿囊液中最低.对125份人工发病鸭肝脏病料、47份可疑DVH肝脏病料和10份可疑DHV分离物的检测符合率为95.1％,表明所建立的单抗AC-ELISA和单抗Dot-ELISA应用效果良好,操作简单、方便,结果特异性强,敏感性高,比较适用于疾病诊断中大批病毒样品的检测。

摘要： 用提纯的IgG包被酶标板,建立了检测DHV的单抗AC-ELISA,确定IgG的最佳包被浓度为1:80,单抗的最佳稀释度为1:100(效价1:102;400),经比较表明该IgG包被法要优于单抗包被.同时还建立了检测DHV的单抗Dot-ELISA,确定最佳点样量为2.723g/dot,最小检出量为1.362g/dot,单抗最佳稀释度为1:400(效价1:102,400).两种方法均能特异地从病料中检出DHV,对接毒后的死亡胚各部分检测结果表明,胚肝中病毒含量最高,而尿囊液中最低.对125份人工发病鸭肝脏病料、47份可疑DVH肝脏病料和10份可疑DHV分离物的检测符合率为95.1％,表明所建立的单抗AC-ELISA和单抗Dot-ELISA应用效果良好,操作简单、方便,结果特异性强,敏感性高,比较适用于疾病诊断中大批病毒样品的检测。

摘要： 研制了兔抗家蚕核型多角体病毒蛋白组份的多克隆抗体，用间接法建立了家蚕核型多角体病毒蛋白的ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ检测方法。此法检测多角体病毒蛋白的灵敏度达１０ｎｇ，与人血清和兔血清无交叉反应，可用于家蚕生物反应器生产的目的蛋白中多角体病毒蛋白组份的检测。

摘要： 研制了兔抗家蚕核型多角体病毒蛋白组份的多克隆抗体，用间接法建立了家蚕核型多角体病毒蛋白的ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ检测方法。此法检测多角体病毒蛋白的灵敏度达１０ｎｇ，与人血清和兔血清无交叉反应，可用于家蚕生物反应器生产的目的蛋白中多角体病毒蛋白组份的检测。

摘要： 研制了兔抗家蚕核型多角体病毒蛋白组份的多克隆抗体，用间接法建立了家蚕核型多角体病毒蛋白的ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ检测方法。此法检测多角体病毒蛋白的灵敏度达１０ｎｇ，与人血清和兔血清无交叉反应，可用于家蚕生物反应器生产的目的蛋白中多角体病毒蛋白组份的检测。