亚油酸异构酶

摘要： 共轭亚油酸(CLA)是亚油酸(LA)的一组位置和空间异构体的总称,其中具有生理活性的异构体是c9,t11-CLA和t10,c12-CLA,它们具有丰富的营养价值和医药价值。在乳球菌属和链球菌属等乳酸菌、丙酸杆菌、瘤胃细菌以及其它菌属中,分离纯化得到的亚油酸异构酶,可催化LA异构化为CLA,利用酶法合成CLA可以有效弥补传统化学合成法的缺陷。本文概述了近年来国内外利用紫外、微波、等离子体诱变、离子注入等物理或化学方法诱变、改造亚油酸异构酶,优化产酶条件和酶学特性,还阐述利用定点突变、基因敲除等基因工程方法,对生产菌株进行改造和培养条件优化,提高CLA产量的相关研究,为进一步筛选出高产共轭亚油酸菌株和CLA的产业化应用提供理论依据。

摘要： 来源于痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)的亚油酸异构酶(PAI)是一种能够通过单酶催化,生成共轭亚油酸(t10,c12-CLA)的亚油酸异构酶.为实现PAI的高效表达,以pPink为表达载体,毕赤酵母(PichiaPinkTM Strain2)为宿主菌,构建毕赤酵母重组菌株(Pichia-pPink-His-opai),实现了PAI在毕赤酵母中的异源表达.对毕赤酵母重组菌进行初步筛选获得蛋白表达量最高的转化子,通过单因素实验优化毕赤酵母重组菌的诱导条件.毕赤酵母重组菌最佳诱导条件为:诱导时间24 h,诱导剂甲醇体积分数2％.在最佳诱导条件下,将毕赤酵母重组菌制成静息细胞催化剂催化合成t10,c12-CLA.在28°C、200 r/min、亚油酸质量浓度4g/L、反应时间6h条件下,t10,c12-CLA产量为2.12 g/L,转化率可达53％.

摘要： 共轭亚油酸(conjugated linoleic acid,CLA)是十八碳二烯酸的异构体.通过食物摄入的CLA不能达到每日推荐摄入量,而CLA又具有减肥、抗癌、抗Ⅱ型糖尿病等多种生理功能,故CLA逐渐成为研究热点.与化学合成CLA相比,微生物合成CLA更具有优势.乳酸菌(lactic acid bacteria,LAB)具有安全性和益生功能,利用乳酸菌合成CLA是一个理想的途径.目前已发现多种产CLA乳酸菌,人们使用乳酸菌发酵油酸、牛乳、植物油合成CLA,并取得了良好的效果.亚油酸异构酶(linoleate isomerase,LAI)对乳酸菌合成CLA起重要作用,但其对乳酸菌合成CLA的作用机理还不明确.一些学者对乳酸菌合成CLA的中间产物进行了研究,发现乳酸菌合成CLA有多种中间产物.乳酸菌合成CLA的代谢机制目前尚不清楚.乳酸菌合成CLA对食品工业有重要意义,也为功能性食品的开发提供了新机遇.本文主要对CLA的生理功能、产CLA乳酸菌、乳酸菌合成CLA的底物、乳酸菌合成CLA的途径进行了概述.

摘要： 共轭亚油酸(CLA)广泛存在于多种食物中,具有减肥、抗癌、抗动脉粥状硬化和抗糖尿病等诸多生理活性.为了获得活性CLA高产,本文将突变的亚油酸异构酶克隆到大肠杆菌中表达,单因素试验确定最优产酶条件为发酵时间18h、IPTG诱导浓度0.2 mmol/L、20％装液、培养基初始pH7、诱导前菌体生物量OD600=0.4、LA浓度0.5 mg/mL、离子浓度0.02％;在此基础上采用响应曲面法优化重组大肠杆菌培养条件提高生产亚油酸异构酶的能力,根据响应面法实验结果分析显示,发酵时间、诱导前生物量和LA浓度对重组亚油酸异构酶的表达有显著影响且均为正效应.三个影响因素最佳组合为发酵时间19.5 h、诱导前生物量OD600=0.47和LA浓度0.57 mg/mL,此时预测亚油酸异构酶催化LA转化为CLA最大量为143.33 gg/mL.验证显示,发酵CLA的产量为141.75±0.14μg/mL,与预测产量相符;通过优化设计,提高了107.5％.

摘要： 对嗜酸乳杆菌进行ARTP多轮诱变处理,筛选出1株亚油酸异构酶高产菌株,研究了碳源、氮源、碳氮比、培养时间、培养温度、初始pH对其产酶的影响,并通过响应面实验对产酶条件进行了优化.结果表明,最佳碳源为2％的葡萄糖,最佳氮源为2％的牛肉膏,当碳氮比为1∶1.5,培养时间为36 h,培养温度为36.4°C,初始pH为5.6时,诱变菌株酶活达到1 214.1 U/mL,是原始菌株的2.84倍.

摘要： Lactobacillus casei Fx was isolated from cattle rumen for its ability to transform linoleic acid into c9,t11-conjugated linoleic acid (CLA).Genomic DNA was extracted and a 1 700-bp linoleic acid isomerase (LAI) gene fragment was amplified from the strain by PCR.The gene fragment was purified and cloned into the plasmid pUCm-T-LAI to obtain recombinant plasmid pUCm-T-LAI by TA cloning.The recombinant plasmid and the expression plasmid pET-DsbA were subjected to double enzyme digestion and ligated to the recombinant expression vector pET-DsbA-LAL After identification by PCR and enzymatic digestion,the recombinant expression vector was transformed into E.coli BL21.The recombinant strain,having LAI activity,possessed the ability to specifically transform linoleic acid into c9,t11-CLA isomer.The results showed that the LAI gene from L.casei Fx was successfully cloned.This work makes it possible to understand the difference among the LAI genes in different rumen bacteria.%以从黄牛瘤胃中分离到的一株具有将亚油酸转化为c9,t11-共轭亚油酸(conjugated linoleic acid,CLA)的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)Fx为出发菌株,提取其基因组DNA,聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增得到1 700 bp大小的亚油酸异构酶(linoleic acid isomerase,LAI)基因片段,将该基因片段纯化后进行TA克隆,得到重组质粒pUCm-T-LAI,将重组质粒pUCm-T-LA琊表达质粒pET-DsbA同时进行双酶切,连接得到重组表达载体pET-DsbA-LAI,经PCR鉴定和酶切后,将重组表达载体转化到大肠杆菌BL21中,得到具有LAI 活性的重组菌株,能将亚油酸转化为c9,t11-CLA,表明从Lactobacillus casei Fx成功克隆LAI,该研究将有助于深入了解不同瘤胃细菌特异性合成不同CLA异构体的LAI基因差异.

摘要： 采用重组解脂耶氏酵母全细胞催化合成反10,顺12-共轭亚油酸(t10,c12-CLA)单体,为了提高t10,c12-CLA的产量,对全细胞催化条件进行优化.通过含有油酸的培养基摇瓶培养36 h获得菌体细胞,经反复冻融处理制备全细胞催化剂.优化后的催化体系条件为:温度28°C,磷酸盐缓冲液(pH 7)浓度0.1 mol/L,转速200 r/min,无需限制氧气.在优化后的反应条件下催化反应40 h,t10,c12-CLA产量达到15.6 g/L,转化率为62.2％.

摘要： 以植物乳杆菌P-8 (Lactobacillus plantarum subsp.plantarum P-8)亚油酸异构酶为研究对象,通过http://swissmodel.expasy.org/,http://smart.embl-heidelberg.de/和vecter NTI等在线工具与软件,对亚油酸异构酶进行生物信息学分析并预测与酶活性相关的位点,预测亚油酸异构酶的3个氨基酸可能为第68位甘氨酸、第107位精氨酸和第172位组氨酸.设计1对含突变的引物,以重组质粒pQE30-LAI为模板,利用PCR介导的定点突变技术构建突变体.经序列比对表明,成功构建了突变体G68A(甘氨酸突变为丙氨酸)、R107L(精氨酸突变为亮氨酸)和H172P(组氨酸突变为脯氨酸),为进一步研究LAI的结构和功能奠定了基础.

摘要： 以植物乳杆菌P-8 (Lactobacillus plantarum subsp.plantarum P-8)亚油酸异构酶为研究对象,通过http://swissmodel.expasy.org/,http://smart.embl-heidelberg.de/和vecter NTI等在线工具与软件,对亚油酸异构酶进行生物信息学分析并预测与酶活性相关的位点,预测亚油酸异构酶的3个氨基酸可能为第68位甘氨酸、第107位精氨酸和第172位组氨酸.设计1对含突变的引物,以重组质粒pQE30-LAI为模板,利用PCR介导的定点突变技术构建突变体.经序列比对表明,成功构建了突变体G68A(甘氨酸突变为丙氨酸)、R107L(精氨酸突变为亮氨酸)和H172P(组氨酸突变为脯氨酸),为进一步研究LAI的结构和功能奠定了基础.

摘要： 本文介绍了天然共轭亚油酸（CLA）的合成途径，生物转化合成CLA的机理，CLA在异源宿主中的转化合成，CLA转化率一直难以提高，主要原因有1）微生物能转化LA合成CLA，但CLA并不是碳代谢的最终产物，生长阶段细胞可能会将转化底物LA和催化底物CLA作为碳源消耗，造成产物难以积累;2)不同宿主密码子偏好性的差异，以及原核生物与真核生物在蛋白表达及后修饰等方面机制的不同，使得亚油酸异构酶基因在异源宿主中的稳定性和表达效率还比较低。因此，通过理性的菌种改造来构建亚油酸异构酶高效表达的共轭亚油酸的基因工程高产菌株，系统研究其中CLA的合成、积累及转化规律，将成为该领域未来的发展方向。

摘要： 本发明公开了一种从亚油酸异构酶产生菌中提取纯化亚油酸异构酶的方法。该方法包括：1)用超高压均质法破碎亚油酸异构酶产生菌的菌体细胞，得到均质液，将该均质液进行离心，收集含有蛋白质的上清液得到粗酶液；2)进行(NH4)2SO4饱和度为60-90％的(NH4)2SO4分级沉淀，收集沉淀，用磷酸钾缓冲液悬浮，得到粗酶液；3)将粗酶液进行进行离子交换层析；所述离子交换层析采用pH为5.5-7.0、摩尔浓度为0.1-0.7mol/L的NaCl溶液进行线性洗脱将酶液进行凝胶过滤层析，收集具有亚油酸异构酶活性的洗脱峰酶液；4)用摩尔浓度为0.08-0.15mol/L、pH为5.5-7.0的磷酸钾缓冲液进行透析脱盐；5)进行凝胶过滤层析，所述凝胶过滤层析中采用的洗脱液为摩尔浓度为0.08-0.15mol/L、pH为5.5-7.0的磷酸钾缓冲液得到亚油酸异构酶。

摘要： 本发明公开了一种亚油酸异构酶及其在共轭亚油酸生产中的应用，属于蛋白质工程和微生物工程技术领域。本发明的来源于双岐杆菌的亚油酸异构酶可用于生产共轭亚油酸，将含有本发明亚油酸异构酶的重组大肠杆菌加入含亚油酸的反应体系中反应3h，即可使共轭亚油酸的转化率高达12.1～42.1％，且可使共轭亚油酸中cis9,trans11‑CLA的含量高达84.3～89.1％，该结果为通过基因工程手段进一步获得安全性高、产量高且所产得的共轭亚油酸单体多为cis9,trans11‑CLA的微生物提供了充实的理论支持。

摘要： 本发明公开了一种酿酒酵母展示亚油酸异构酶催化合成共轭亚油酸的方法，将含有重组质粒的酿酒酵母K601，接种到YPG培养基中，诱导培养，收集菌体，洗涤，得到酿酒酵母展示亚油酸异构酶催；然后将得到的酿酒酵母展示亚油酸异构酶加入到含有亚油酸的缓冲液中，振荡反应。本发明将亚油酸异构酶展示表达在酿酒酵母细胞外表面，直接与底物亚油酸接触，提高共轭亚油酸的转化效率，降低生产成本。

摘要： 本发明公开了一种利用亚油酸异构酶生产共轭亚油酸的方法。该利用亚油酸异构酶生产共轭亚油酸的方法，是将亚油酸和亚油酸异构酶在超临界二氧化碳中反应1至3小时，得到共轭亚油酸；所述反应的压力为25-35Mpa，反应温度为32-44°C。本发明利用超临界流体-超临界二氧化碳作为酶催化反应介质，降低了生产成本低，安全环保，提高共轭亚油酸的转化率。

摘要： 本发明公开了亚油酸异构酶在脱氢和异构方面的双重用途。该用途是双功能酶PAI作为delta-12脂肪酸脱氢酶和亚油酸异构酶，或delta-12脂肪酸脱氢酶的应用；所述双功能酶PAI是如下a)或b)蛋白质：a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)将序列表中序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有delta-12脂肪酸脱氢酶和亚油酸异构酶，或delta-12脂肪酸脱氢酶活性由a)衍生的蛋白质。本发明为进一步研究pai基因功能以及利用双功能酶PAI生物合成t10c12-CLA的相关应用性研究提供了依据和方法。

摘要： 本发明公开了一种从亚油酸异构酶产生菌中提取纯化亚油酸异构酶的方法。该方法包括：1)用超高压均质法破碎亚油酸异构酶产生菌的菌体细胞，得到均质液，将该均质液进行离心，收集含有蛋白质的上清液得到粗酶液；2)进行(NH4)2SO4饱和度为60－90％的(NH4)2SO4分级沉淀，收集沉淀，用磷酸钾缓冲液悬浮，得到粗酶液；3)将粗酶液进行进行离子交换层析；所述离子交换层析采用pH为5.5－7.0、摩尔浓度为0.1－0.7mol/L的NaCl溶液进行线性洗脱将酶液进行凝胶过滤层析，收集具有亚油酸异构酶活性的洗脱峰酶液；4)用摩尔浓度为0.08－0.15mol/L、pH为5.5－7.0的磷酸钾缓冲液进行透析脱盐；5)进行凝胶过滤层析，所述凝胶过滤层析中采用的洗脱液为摩尔浓度为0.08－0.15mol/L、pH为5.5－7.0的磷酸钾缓冲液得到亚油酸异构酶。

摘要： 本发明公开了一种亚油酸异构酶及其在共轭亚油酸生产中的应用，属于蛋白质工程和微生物工程技术领域。本发明的来源于双岐杆菌的亚油酸异构酶可用于生产共轭亚油酸，将含有本发明亚油酸异构酶的重组大肠杆菌加入含亚油酸的反应体系中反应3h，即可使共轭亚油酸的转化率高达12.1～42.1％，且可使共轭亚油酸中cis9,trans11‑CLA的含量高达84.3～89.1％，该结果为通过基因工程手段进一步获得安全性高、产量高且所产得的共轭亚油酸单体多为cis9,trans11‑CLA的微生物提供了充实的理论支持。

摘要： 本发明公开了一种酿酒酵母展示亚油酸异构酶催化合成共轭亚油酸的方法，将含有重组质粒的酿酒酵母K601，接种到YPG培养基中，诱导培养，收集菌体，洗涤，得到酿酒酵母展示亚油酸异构酶催；然后将得到的酿酒酵母展示亚油酸异构酶加入到含有亚油酸的缓冲液中，振荡反应。本发明将亚油酸异构酶展示表达在酿酒酵母细胞外表面，直接与底物亚油酸接触，提高共轭亚油酸的转化效率，降低生成成本。

摘要： 本发明公开了一种利用亚油酸异构酶生产共轭亚油酸的方法。该利用亚油酸异构酶生产共轭亚油酸的方法，是将亚油酸和亚油酸异构酶在超临界二氧化碳中反应1至3小时，得到共轭亚油酸；所述反应的压力为25－35MPa，反应温度为32－44°C。本发明利用超临界流体－超临界二氧化碳作为酶催化反应介质，降低了生产成本低，安全环保，提高共轭亚油酸的转化率。

摘要： 本发明公开了亚油酸异构酶在脱氢和异构方面的双重用途。该用途是双功能酶PAI作为delta-12脂肪酸脱氢酶和亚油酸异构酶，或delta-12脂肪酸脱氢酶的应用；所述双功能酶PAI是如下a)或b)蛋白质：a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)将序列表中序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有delta-12脂肪酸脱氢酶和亚油酸异构酶，或delta-12脂肪酸脱氢酶活性由a)衍生的蛋白质。本发明为进一步研究pai基因功能以及利用双功能酶PAI生物合成t10c12-CLA的相关应用性研究提供了依据和方法。