重组水蛭素

摘要： 水蛭素是一种高效的天然凝血酶特异性抑制剂,具有抗凝血、抗血栓、促进微血管生成、抗纤维化、抗肿瘤、抗高尿酸血症、改善脑出血、抗动脉粥样硬化和改善糖尿病并发症等多种药理作用,可用于多种疾病的临床治疗。本文对近年来水蛭素药理作用相关的国内外文献进行分析和总结,为水蛭素的进一步研究和开发应用提供参考。

摘要： 水蛭素(hirudin)为特异性凝血酶抑制剂,根据其来源可分为天然水蛭素和重组水蛭素两类.水蛭素具有抗凝、抗血栓、抗纤维化、抗细胞凋亡、舒血管和提高随意皮瓣成活率等多种药理作用,对于血管瘤、肝癌、动脉粥样硬化症、肾病综合征、高尿酸血症、输卵管炎性阻塞和白内障等疾病均具有显著的治疗作用.对近年来水蛭素的相关研究进行综述,为其进一步研发提供参考.

摘要： 目的:研究重组水蛭素抗血栓形成的作用及机制.方法:将60只雄性昆明小鼠随机分为对照组、模型组、阿司匹林组和重组水蛭素低、中、高剂量组(n=10).除对照组外,其余各组小鼠分别腹腔注射角叉菜胶2.5mg/kg,诱发小鼠尾部血栓形成.注射角叉菜胶前24 h、0.5h和注射后24h,阿司匹林组小鼠分别腹腔注射阿司匹林25 mg/kg,重组水蛭素低、中、高剂量组小鼠分别腹腔注射0.05、0.1、0.2 mg/kg重组水蛭素,对照组和模型组小鼠分别腹腔注射等体积生理盐水.注射角叉菜胶后48 h,观察小鼠黑尾长度并计算黑尾发生率;检测血浆凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTr)、组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)、纤溶酶原激活物抑制因子-1(PAI-1)、6-酮-前列腺素F1α (6-keto-PGF1 α)、血栓恶烷B2 (TXB2)水平.结果:与对照组比较,模型组小鼠尾部形成血栓;血浆PT明显缩短(P＜0.01),PAI-1、TXB2水平明显升高(P＜0.01),t-PA、6-keto-PGF1 α水平明显降低(P＜0.01).与模型组比较,重组水蛭素低、中、高剂量组和阿司匹林组小鼠尾部血栓长度明显缩短(P＜0.05或P＜0.01),PT明显延长(P＜0.01),PAI-1、TXB2水平明显降低(P＜0.01),t-PA、6-keto-PGF1 α水平明显升高(P＜0.01).与阿司匹林组比较,重组水蛭素低剂量组小鼠尾部血栓长度明显增加(P＜0.05),PT明显缩短(P＜0.01),PAI-1、TXB2水平明显升高(P＜0.01);重组水蛭素低、中剂量组6-keto-PGF1 α水平明显降低(P＜0.01,P＜0.05);重组水蛭素中剂量组PAI-1、TXB2水平明显升高(P＜0.01,P＜0.05).结论:重组水蛭素有明显抗血栓形成作用,其机制可能与影响外源性凝血系统、促进纤溶功能有关.

摘要： 目的:研究重组水蛭素肠溶胶囊单次和多次给药在Beagle犬体内的药动学特征.方法:取12只Beagle犬按随机对照法分为单次ig组和单次iv组,每组6只,按0.2 mg/kg ig或iv重组水蛭素,收集血样;清洗2周后12只犬按0.2 mg/kg ig重组水蛭素,连续给药7 d,收集血样,作为多次ig组.采用酶联免疫吸附法测定血浆中重组水蛭素浓度,以DAS 2.0软件计算药动学参数.结果:单次ig和单次iv重组水蛭素在Beagle犬体内药动学特征均符合二室模型,ig重组水蛭素肠溶胶囊的绝对生物利用度为(14.908±1.868)%;单次ig组和多次ig组犬体内重组水蛭素的tpeak分别为(2.105±0.243)、(3.000±0.000)h,t1/2β分别为(8.660±2.965)、(14.870±2.710)h,cmax分别为(10.700±0.872)、(12.05±1.587)ng/mL,AUC0-1440 min分别为(55.250±4.386)、(58.978±6.002)ng·h/mL,两组间差异无统计学意义(P>0.05).结论:ig重组水蛭素肠溶胶囊可一定程度被吸收入血;连续多天ig重组水蛭素肠溶胶囊在犬体内不产生蓄积,不改变其药动学特征.%OBJECTIVE:To study the pharmacokinetic characteristics of Recombinant hirudin enteric-coated capsule by single and multiple administration in Beagle dogs. METHODS:12 Beagle dogs were divided into single ig group and single iv group by random control method,6 in each group. Recombinant hirudin 0.2 mg/kg was intragastrically administrated or intravenously inject-ed,blood sample was collected;after 2 weeks of cleaning,12 dogs were intragastrically administrated recombinant hirudin 0.2 mg/kg,for 7 d. Sample blood was collected,referred to multiple ig group. Recombinant hirudin concentration in plasma was deter-mined by enzyme-linked immunosorbent assay,and pharmacokinetic parameters were calculated by DAS 2.0 software. RESULTS:The results showed that pharmacokinetics by ig and iv recombinant hirudin in Beagle dogs fitted to two-compartment model,abso-lute bioavailability of ig Recombinant hirudin enteric-coated capsule was(14.908±1.868)%;the pharmacokinetic parameters in sin-gle ig group and multiple ig group were tpeak of(2.105±0.243),(3.000±0.000)h,t1/2β of(8.660±2.965),(14.870±2.710)h, cmax of(10.700±0.872),(12.05±1.587)ng/mL,AUC0-1440 min of(55.250±4.386),(58.978±6.002)ng·h/mL,without statistical significances in two groups(P>0.05). CONCLUSIONS:The ig Recombinant hirudin enteric-coated capsule can be absorbed into the blood to a certain extent. There is no accumulation for ig Recombinant hirudin enteric-coated capsule for several days,and it dose not change the pharmacokinetic characteristics.

摘要： 目的:通过局部运用重组水蛭素对大鼠皮肤撕脱伤中黏附因子CD11b/CD18及ICAM-1动态表达的研究,探讨重组水蛭素对皮肤撕脱的保护与该三项指标之间是否有密切关系,以及对撕脱皮瓣成活率的影响变化及作用机理.方法:设计为蒂在侧腹部的任意皮瓣,并给予牵拉证实为撕脱皮瓣后进行实验,实验组注射水蛭素40 IU(1 mL),对照组注射等量生理盐水,正常观察组不做任何处理,直接抽取外周血液及切取皮肤进行检测;实验组及对照组分别于6个时间点抽取外周血,运用流式细胞仪检测CD11b/CD18在中性粒细胞的阳性表达率,切取皮瓣远端组织运用免疫组织化学染色检测血管内皮细胞膜表面ICAM-1的表达并定量分析,综合了解三者的动态变化,留取的大鼠观察皮瓣愈合情况并计算撕脱皮瓣成活率.结果:术后两组皮瓣均出现充血水肿现象,虽然随着时间的推移实验组及对照组CD11b/CD18阳性表达都在上升,但是,局部运用水蛭素后黏附因子阳性表达率明显低于对照组(P<0.05);对照组ICAM-1阳性表达率明显高于实验组(P<0.01);经观察发现实验组皮瓣的愈合成功率较空白对照组有明显的提升.结论:局部运用重组水蛭素对大鼠皮肤撕脱伤具有有效减低血液中黏附因子CD11b/CD18及组织中ICAM-1的作用,减少组织炎症反应,改善缺血再灌注过程中对血管内皮细胞的损伤,从而显著提高皮肤撕脱伤后皮瓣的愈合率.

摘要： 目的 检测喉癌及癌旁组织中蛋白酶活化受体1(PAR-1)、血管内皮生长因子(VEGF)、基质金属蛋白-2(MMP-2)的表达,及重组水蛭素(Recombinant hirudin)对喉癌细胞Hep-2中PAR-1、VEGF、MMP-2表达的影响,探讨PAR-1、VEGF、MMP-2在喉癌侵袭及转移中的作用及重组水蛭素的抗肿瘤机制.方法 采用免疫组化方法检测喉癌组织及癌旁组织中PAR-1、VEGF、MMP-2的表达;用免疫细胞化学方法检测重组水蛭素共培养和不加入重组水蛭素培养的喉癌细胞中PAR-1、VEGF、MMP-2的表达.结果 PAR-1、VEGF、MMP-2在喉癌组织及有淋巴结转移的癌旁组织中呈高表达,差异有统计学意义;PAR-1、VEGF、MMP-2在重组水蛭素共培养和不加入重组水蛭素培养的表达差异有统计学意义(P＜0.05).结论 证实PAR-1、VEGF、MMP-2参与了喉癌的侵袭及转移;重组水蛭素的抗肿瘤及抑制肿瘤转移作用可能与其降低喉癌细胞中PAR-1、VEGF、MMP-2表达有关.

摘要： 目的 探讨重组水蛭素(Recombinant hirudin)对实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠脑组织基质金属蛋白酶-9(MMP-9)表达和一氧化氮(NO)含量的影响.方法 48只雌性C57BL/6小鼠随机平均分为3组,EAE组运用MOG35-55构建EAE小鼠模型,CFA组由生理盐水代替MOG35-55构建模型,水蛭素组在EAE基础上给予重组水蛭素腹腔注射,CFA组、EAE组给予生理盐水腹腔注射.HE染色和LBF染色观察炎症及脱髓鞘情况,免疫组化检测MMP-9表达,ELLISA检测小鼠脑组织中NO含量,RT-PCR检测MMP-9和诱导型一氧化氮合酶(iN-OS) mRNA表达.结果 水蛭素组小鼠临床症状、炎症及脱髓鞘程度减轻,与EAE组间的差异有统计学意义(P＜0.05).水蛭素组小鼠脑组织MMP-9蛋白表达和NO含量与EAE组间差异有统计学意义(P＜0.05),重组水蛭素组小鼠脑组织iNOS mRNA和MMP-9 mRNA表达与EAE组间差异有统计学意义(P＜0.05).结论 重组水蛭素缓解EAE临床症状机制之一可能与抑制EAE小鼠脑组织中MMP-9和iNOS mRNA表达,从而减少MMP-9和NO含量有关.

摘要： Objective To investigate the protective effect and mechanism of recombinant hirudin on avulsed flap and to explore the application of recombinant hirudin in clinical treating avulsed flap.Methods 108 Sprague-Dawley rats were randomly divided into three groups:local injecting recombinant hirudin (group A),local injecting low molecular heparin (group B),and local injecting physiological saline (group C).The far ends were sutured after forming dorsal avulsed flap with local freeing.The levels of P-selectin and VEGF were detected,and the inflammatory cell aggregation and formation of microthrombus were observed in pathological section.On 14th postsurgery day the survival rate of flap was calculated.Results The content of P-selectin in group A was lower than that of groups B and C,with a statistical difference (P＜0.05).The content of VEFG in group A was higher than that of groups B and C,with a statistical difference (P＜0.05).On 14th postsurgery day,group A was higher than that in groups B (P＜0.05)and C (P＜0.01) in the survival rate of flap.Conclusions Locally injected recombinant hirudin can actively suppress the production of P-selectin,reduce accumulation of inflammatory cells,prevent information of microthrombus,improve ischemia and anoxia of avulsed flaps,decrease injuries of endotheliocyte,enhance the expression of VEGF,and stimulate hyperplasia of neogenesis capillaries that elevate survival rate of avulsed flaps.%目的 探讨重组水蛭素对撕脱皮瓣的保护作用及其在临床治疗撕脱皮瓣的应用前景.方法 将108只SD大鼠随机分为重组水蛭素组(A组)、低分子肝素组(B组)、生理盐水组(C组,对照组),并形成撕脱皮瓣后原位缝合.术后即刻、12 h、24 h、48 h,给予皮瓣蒂部、距蒂部2 cm和4 cm3等分点皮下注射重组水蛭素、低分子肝素、生理盐水,于术后12 h、1d、3d、5d、7d,分别检测皮瓣远端组织内P选择素和血管内皮细胞生长因子(VEGF)含量,病理切片观察皮瓣远端组织毛细血管内炎性细胞聚集及微血栓形成情况,术后14d计算皮瓣存活率.结果 A组P选择素含量比B组、C组增加不明显,差异具有统计学意义(P＜0.05),A组VEGF含量比B组、C组明显增加,差异具有统计学意义(P＜0.05);术后14 d皮瓣存活率A组明显高于B组(P＜0.05)和C组(P＜0.01),差异具有统计学意义.结论 局部注射重组水蛭素能有效抑制P选择素的生成,减少炎性细胞的聚集,阻断微血栓的形成,改善撕脱皮瓣的局部缺血、缺氧状态;减弱内皮细胞的损伤,促进VEGF的表达,刺激新生毛细血管增生,提高撕脱皮瓣的存活率.

摘要： 通过测定小鼠的出血时间(BT)和活化部分凝血活酶时间(AP TT),验证乳酸菌表达的重组水蛭素Ⅲ壳聚糖微粒的口服药效学.重组水蛭素样品是由乳酸菌在摇瓶水平30°C静置培养表达的.它的表达是由乳链菌肽诱导的,且表达的蛋白的量受其调控.水蛭素只经过阴离子交换树脂纯化浓缩.最后浓缩的水蛭素样品制成壳聚糖-TPP微粒.30只小鼠,雌雄各半,被随机分为3组:对照组(生理盐水),水蛭素组(500 ATU/kg),阿司匹林组(20 mg/kg).给小鼠灌胃给药后,以剪尾法测定小鼠出血时间,以小鼠毛细管眼眶取血法测定活化部分凝血活酶时间.结果显示给药组与对照组的BT值和APTT值均有显著差异.乳酸菌NICE表达系统分泌表达的重组水蛭素,以壳聚糖-TPP微粒口服制剂口服给药后,证实其口服有效.

摘要： 建立用分光光度法测定重组水蛭素(rH)在大鼠尿中含量的方法,并用该法研究静脉给药后,rH在大鼠尿中的排泄.以甲苯磺酰基-氨基乙酰基-脯氨酰基-精氨酰-对-硝基苯胺(Chromozym TH)为底物,凝血酶能水解Chromozym TH释放出对-硝基苯胺(pNA),pNA在405 nm波长处有特异性吸收,通过测定反应体系中未被rH抑制的凝血酶的量,间接测定rH的含量.结果表明,分光光度法能有效的测定大鼠尿中rH的含量,rH的浓度在6.25～75 ng·mL-1范围内呈线性关系(R2 =0.999 6)；日间和日内精密度RSD均＜10％,方法回收率＞95％,稀释回收率＞93％.应用上述方法测定大鼠iv0.5,1.0及2.0 mg·kg-1 rH后尿药浓度及排泄动力学,0～12 h累计排量分别为(116.850±57.160),(235.544±39.375)和(474.986±85.426) μg·kg-1,与给药剂量成正比；三种剂量的累计排泄率均为给药量的23％左右,与剂量无关,说明rH在大鼠体内的消除方式为一级线性动力学.本方法操作简便、灵敏度高、重现性好,可用于尿中rH的测定.

摘要： 目的：研究重组水蛭素(recombinant hirudin,rH)在大鼠体内的代谢途径及尿中活性代谢产物的提取分离和结构鉴定. 方法：给大鼠静脉注射125I标记的重组水蛭素(N-I1-T2-Y3,125I-rH),分别收集血液样品和尿液样品.将收集的血液样品和尿样品通过凝胶色谱(GF-HPL)并结合γ－计数仪进行分离、分析;收集有放射性活性的尿代谢物,用ELISA法和生色底物法进行活性检测,将有抗凝血酶活性的收集液,进一步用反相高效液相色谱(RP-HPLC)进行纯化,用飞行时间质谱法测定分子量,氨基酸序列测定仪测定氨基酸组成与序列. 结果：重组水蛭素在血液中就已经被代谢;大鼠尿中的代谢产物均无水蛭素样的免疫活性,但有抗凝血酶的生物活性;抗凝血酶活性最强的代谢产物的分子量为5162Da,是由52个氨基酸组成的、rH C端降解的小肽. 结论：本文所建立的重组水蛭素在大鼠体内的代谢与代谢产物的分析和鉴定的方法,具有通用性,适用于其它蛋白类药物的代谢研究.

摘要： 目的：探讨天然、重组水蛭素对大鼠随意皮瓣淤血模型成活保护机制作用，以及对皮瓣VEGF的作用是否相同。rn 方法：Wistar 大鼠30 只，雌雄不限。背部设计随意皮瓣10cm×3cm制成淤血模型。皮瓣随机分为A、B、C 3 组（n=30）。分别于皮下注射5u 天然水蛭素; 5u 重组水蛭素；生理盐水。术后测定VEGF 含量，第7 天计算皮瓣成活率。rn 结果：免疫组化测定VEGF、荧光RT-PCR 测定VEGFmRNA 表达量用药组（A 组和B 组）比对照组（C 组）明显增多，用药组皮瓣成活率比对照组高。rn 结论：天然、重组水蛭素能够促进随意皮瓣VEGF 表达，有利于新生血管的生成，能够提高随意皮瓣的成活率，天然水蛭素效果优于重组水蛭素。

摘要： 目的:研究重组水蛭素(rH)在纤溶过程中的作用,并分析可能的机理.方法:采用同位素示踪技术,分析rH对动物血栓模型中凝血酶(Th)及纤维蛋白的影响.采用组织纤溶酶原激活物(tPA)为纤溶激酶的体外溶栓模型,分析rH对纤溶的影响.结果:标记了99mTc的犬股动、静脉血栓于30 min开始显影,随后各时相血栓影像趋清晰;体外纤溶结果显示rH添加组较对照组没有纤溶再凝现象.TM的添加显著延长纤溶时间,土豆羧肽酶抑制剂(CPI)可缩短由TAFIa活化造成的纤溶时间的延长,rH的添加可以使TAFIa的活化被抑制.较低浓度rH(＜0.5 U/ml)的添加使血浆中FXⅢ的活化受抑制,并且使纤溶产物D-二聚体(D-Dimer)的水平升高.结论:rH可有效抑制结合在纤维蛋白上的Th;rH可以通过抑制TAFIa和FXⅢ的活化,以达到促进纤溶的作用.

摘要： 目的 水蛭素因血浆半衰期短而严重限制了其临床应用，聚乙二醇修饰能有效地延长其半衰期。本文通过比较不同修饰位点、修饰方法所得单修饰产物的比率、纯度及其活性保留率，从而得到修饰专一性强且活性保留率较高的修饰策略。方法采用液相和固相修饰方法,用琥珀酰亚胺活化的PEG 20kDa分别在pH6.0、8.0的条件下对水蛭素的His和Lys进行定点修饰；用SDS-PAGE分析产物的修饰度，并用离子交换柱对修饰后的产物进行分离，然后用凝血酶滴定法测定水蛭素单修饰产物的体外抗凝活性。另外用分子动力学模拟方法预测了pH8.0条件下PEG修饰的位点。结果在pH6.0、8.0的条件下，水蛭素单修饰率都高达90%以上，但二者的单修饰活性保留率相差较大。在pH6.0时，液、固相单修饰活性保留率为34%、34.8%；而在pH8.0时分别为55%、96%。结论 在pH8.0条件下，采用“离子交换柱辅助”固相修饰的方法对Lys进行定点修饰能得到较高产率和较高活性保留率的单修饰产物。

摘要： 本文采用酶联免疫分析检测(ELISA)法测定犬血浆中的药物质量浓度,血药浓度-时间数据用3P97药动程序拟合分析并计算药动学参数。结果表明，该药在体内消除符合二房室模型.6只Beagle犬的平均消除半衰期t1/2β为(20.0±1.7)min,平均消除速率CL为(10.6±1.3)mL/(kg·min),药时曲线下面积AUC0～180min为(37.3±3.9)μg·min/mL。

摘要： 本发明涉及一种诱导液及其制备方法，诱导液选用刺激性食材制备而成，该诱导液可促进水蛭和/或蚯蚓分泌并吐出水蛭素和/或蚓激酶。还提供水蛭素和/或蚓激酶的提取方法，利用所述诱导液从活体水蛭和/或蚯蚓提取水蛭素和/或蚓激酶，水蛭素和/或蚓激酶产量高，且最大限度保留水蛭素和蚓激酶的活性含量。还提供水蛭素蚓激酶口服液及其制备方法和应用，以所述诱导液诱导，让活体吸血水蛭分泌并吐出水蛭素，让赤子爱胜蚓分泌并吐出蚓激酶，并且保住了水蛭和蚯蚓中其它的药性成份。本发明专利克服了水蛭素和蚓激酶中含有大量杂质难于滤除的弊端，且无腥臭味，同时最大限度保留水蛭素和蚓激酶的活性含量和药性，简单易操作，抗栓溶栓疗效明显提高。

摘要： 本发明涉及一种药用原料成分的提取方法及设备，具体是涉及一种水蛭素提取瓶、水蛭素提取方法。具有高度为30cm，内径为20cm，外径为21cm的圆柱状玻璃瓶；玻璃瓶内部的中部设有环状卡台，卡台内嵌有可拆式筛网，筛网孔径为60目；玻璃瓶外侧距底部15cm处设有茶壶口形状的排出口。打开盖体，将活体水蛭放置于筛网之上1～3h后，水蛭全身发出粘液，自玻璃瓶顶部放入水，对水蛭进行冲洗，含粘液的水通过筛网进入玻璃瓶内底端，冲洗完成后，倾斜玻璃瓶，处于混合液上层的水通过排出口排出玻璃瓶的外部，下层物质留置于玻璃瓶中24h即呈块状，打开可拆式筛网，取出块状物质即可。本发明既对水蛭进行有效保护，又能使水蛭素提取的产量得到提升。

摘要： 本发明涉及由水蛭素和一种或多种亲脂化合物形成的水蛭素结合物，其中，所述亲脂化合物的辛醇/水分配系数大于1.8，而且与水蛭素化学相连，并涉及其制备和其应用。

摘要： 利用蛋白质工程原理和方法，在蛋白质相互作用分析以及药理学实验基础上，本专利制备了具有较高抗凝血活性的菲牛蛭基因突变水蛭素HM2‑E60D‑I62D。以HM2‑E60D‑I62D为模板，在分析血液蛋白酶的酶切位点以及人工定向进化随机突变基础上，制备血浆代谢速度较缓慢的HM2‑E60D‑I62D突变蛋白：HM2‑E60D‑I62D‑K26H、HM2‑E60D‑I62D‑L30I、HM2‑E60D‑I62D‑K47H、HM2‑E60D‑I62D‑S48T、HM2‑E60D‑I62D‑K26H‑L30I‑K47H‑S48T和HM2‑E60D‑I62D‑T43S。本发明专利说明书详细介绍了以上菲牛蛭基因突变水蛭素以及它们的制备方法和药理学作用。

摘要： 本发明公开了一种含有医用水蛭素基因的重组真核汉逊酵母工程菌株的构建及重组水蛭素的生产工艺。其中采用汉逊多型宿主细胞株RB-11为出发菌株来构建适用于生产的含有水蛭素的汉逊酵母高表达工程菌株RBHV145-6，并通过培养、发酵来获得高纯度和高含量的水蛭素。在本发明中，水蛭素基因以多拷贝的形式拷贝到宿主细胞的染色体上，且拷贝数保持稳定，含有水蛭素基因的外源基因表达盒完全整合到宿主细胞染色体上，种子库细胞、传代40、80代后的细胞中均无游离质粒存在，外源蛋白的表达量和分泌效率比酿酒酵母高10倍，特别和国内的多型汉逊酵母相比水蛭素外源蛋白的表达量高35.8％，且没有过度糖基化现象，因此适合于大规模发酵生产目的蛋白。

摘要： 本发明公开了一种具有靶向和长效功能的重组水蛭素融合蛋白及其编码基因和应用。所述融合蛋白，由“促凝血小板”靶向结合肽、水蛭素，以及白蛋白结合结构域融合组成。该融合蛋白具有前药性质，能体内快速激活、发挥抗血栓形成效应；且和水蛭素的效应相当，但抗凝效应的持续时间和水蛭素相比显著延长，出血时间和水蛭素相比显著减少，接近于生理盐水的水平，系统性出血风险非常低，具有广阔的应用前景。

摘要： 本发明涉及生物医药的分离纯化技术领域，具体涉及一种去除重组水蛭素蛋白溶液中内毒素的方法，采用阴离子交换色谱法进行分离，包括如下步骤：进样：取重组水蛭素蛋白溶液进样，进样量为色谱柱最大载样量的25～40％，用平衡液冲洗进行柱平衡；洗脱：用洗脱液进行等度洗脱，并收集流出部分，得到重组水蛭素洗脱液；柱再生：用再生液进行等度洗脱，并收集流出部分，得到内毒素洗脱液。本发明根据重组水蛭素和内毒素在中性条件下与阴离子交换剂吸附作用的强弱，通过增加流动相中的盐浓度进行等度洗脱，通过进样量的调控来实现良好的去除效果，保证了较高的蛋白回收率，同时实现了色谱柱的再生，该方法简单、高效、成本低，适用于工业化生产。

摘要： 本发明公开了一种含有医用水蛭素基因的重组真核汉逊酵母工程菌株的构建及重组水蛭素的生产工艺。其中采用汉逊多型宿主细胞株RB-11为出发菌株来构建适用于生产的含有水蛭素的汉逊酵母高表达工程菌株RBHV145-6，并通过培养、发酵来获得高纯度和高含量的水蛭素。在本发明中，水蛭素基因以多拷贝的形式拷贝到宿主细胞的染色体上，且拷贝数保持稳定，含有水蛭素基因的外源基因表达盒完全整合到宿主细胞染色体上，种子库细胞、传代40、80代后的细胞中均无游离质粒存在，外源蛋白的表达量和分泌效率比酿酒酵母高10倍，特别和国内的多型汉逊酵母相比水蛭素外源蛋白的表达量高35.8％，且没有过度糖基化现象，因此适合于大规模发酵生产目的蛋白。

摘要： 一种用于生产磺基化重组水蛭素的重组菌及其制备方法与应用，属于基因工程技术领域。为了提高磺基化重组水蛭素的合成产量，降低生产成本，本发明提供了一种用于生产磺基化重组水蛭素的重组菌，所述重组菌过表达磺基化酶基因和水蛭素基因，出发菌株为大肠杆菌；所述水蛭素基因，核苷酸序列为SEQ ID No.1‑SEQ ID No.3中的一种，所述磺基化酶基因，核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。本发明显著提升了重组水蛭素的活性，且实现了水蛭素的一步纯化方法，能够一次性获得具有较高纯度的重组水蛭素产物，这极大的减轻了后续纯化的压力。

摘要： 本发明涉及生物材料技术领域，公开了利用多巴胺和重组水蛭素复合构建抗凝血表面涂层的方法，包括多巴胺修饰、重组水蛭素在材料表面功能修饰；还提供了抗凝血表面涂层及应用。本发明方法简便易操作，显著提高了基底表面的抗凝血性能，抑制了血小板粘附，且所构建的材料表面具有良好的生物学性能，无毒性；本发明为医用材料的产业升级和临床应用提供了理论与实验依据，具有广阔的应用前景及重要的社会经济价值，对促进医疗器械与生物医用材料产业的发展、培育战略性新兴产业也有重要的意义。