酵母双杂交系统

摘要： 为构建捻转血矛线虫cDNA文库,进一步研究捻转血矛线虫蛋白互作机制以及为筛选捻转血矛线虫互作蛋白提供依据,本研究以捻转血矛线虫L3期幼虫为材料,利用TriZol法提取捻转血矛线虫总RNA;使用试剂盒构建捻转血矛线虫的cDNA文库,并对cDNA进行均一化处理,再将纯化后的cDNA与线性化的pGADT7-Rec重组构建的文库质粒转化至Y187酵母中,构建出酵母转录激活结构域(activationdomain,AD)文库。结果表明:本研究构建了重组率为100%,插入片段平均长度为1000 bp,工作液细胞密度大于3.5×10^(7)CFU/mL的捻转血矛线虫均一化酵母AD文库;所构建的表达文库各项指标均达标,符合酵母双杂交筛选要求。本文库为捻转血矛线虫的分子机制研究以及疫苗的开发奠定了基础。

摘要： 酵母双杂交系统是目前鉴定体内蛋白相互作用最有效、应用最广泛的一项技术.为了将其运用于本科实验教学,设计了"利用酵母双杂交系统验证HIF-1α与Jab1相互作用"综合性实验.实验包括检测HIF-1α和Jab1在酵母细胞中的表达、毒性及自激活检测、HIF-1α与Jab1相互作用验证三部分.实验操作性强、结果直观,有利于学生深入、系统地理解并掌握酵母双杂交系统技术,有利于提高学生的科研思维及科研素养,有利于促进教学与科研的相互融合.

摘要： [目的]OsRRK1(Rop-interacting receptor-like kinase 1)蛋白是水稻中第一个被研究的类胞质受体激酶RLCKⅥ家族蛋白.在调控水稻叶片的卷曲和对褐飞虱的防御中都起着重要作用,但是其调控机理尚不清楚.本研究试图进一步探究OsRRK1基因抗褐飞虱的机理.[方法]利用酵母双杂交的方法分析OsRRK1蛋白与OsLecRK(lectin-like receptor kinase)、OsLecRK1、OsLecRK2、OsLecRK3的互作关系,OsLecRK是抗褐飞虱基因BPH15区间的候选基因,是水稻先天免疫系统中一个重要成员,既参与水稻先天免疫反应,包括对褐飞虱、白叶枯病和稻瘟病的抗性,又参与水稻的发育过程.OsLecRK1、OsLecRK2、OsLecRK3的基因簇组成抗褐飞虱基因BPH3,含BPH3基因的水稻具有广谱、持久的抗虫性.同时利用DNAMAN软件分析OsLecRK蛋白与OsLecRK1、OsLecRK2、OsLecRK3的同源性.[结果]DNAMAN的分析结果显示OsLecRK与OsLecRK1、OsLecRK2、OsLecRK3的同源性都很高,蛋白一致性在50％以上;酵母双杂交结果显示OsRRK1与OsLecRK、OsLecRK2和OsLecRK3互作.[结论]OsRRK1通过与抗褐飞虱基因BPH15和BPH3候选基因的相互作用参与水稻抗褐飞虱过程.

摘要： 为了检测环境中潜在的LXRα效应物质.本研究以LXRα蛋白为例,利用核受体蛋白与小分子亲和结合的原理,构建了pCold-TF-LXRα重组蛋白并优化了重组蛋白的表达条件,建立了特异性捕获活性物质的方法.结果表明:诱导温度为20°C、诱导剂IPTG浓度为0.4mmol/L为重组蛋白的最佳表达条件;同时,利用LXRα 激动剂T09013174个梯度浓度(0.25,2.5,25,250μg/L)的加标回收率实验测得线性回归曲线为y=0.83604x+0.40763,R2=0.9948,证明方法具有有效性;对比pCold-TF空载体蛋白(6.42％)和重组蛋白(79.83％)对T0901317(250μg/L)的回收率,说明方法具有特异性.为了验证方法的实用性,将重组蛋白与15种典型的有机磷酸酯类化合物(OPEs)的混合标样进行"捕获"实验,证明了TPHP、BPADP、TCrP、EHDPP、TNBP、RDP、TEHP、TDCIPP具有LXRα的活性效应.最后,用酵母双杂交实验验证了这8种OPEs均为LXRα的拮抗剂.

摘要： 类受体蛋白激酶(receptor-like protein kinases,RLKs)作为重要的信号分子受体,在植物生长发育过程中起着重要的调控作用.RLKs主要通过胞内的激酶区磷酸化其底物蛋白来发挥作用,因此鉴定RLKs的底物蛋白对于其功能的研究至关重要.本研究利用酵母双杂交系统对FTPK1的互作蛋白进行筛选,初步确定了两个候选蛋白,为进一步研究该激酶的功能奠定了基础.

摘要： The phytohormone abscisic acid (ABA ) is crucial for plant development and response to abiotic stress ,including drought .ABA perceived by the ABA receptors ,PYR/PYL/RCAR ,which bound to ABA , and then recruit Protein phosphatase 2C (PP2C) to inhibit the PP2C acticity ,thereby activating SNF1-RELAT-ED PROTEIN KINASE2 (SnRK2s) .Here ,CARK3 and RCAR12 interact in yeast two-hybrid system and GST-pull down in vitro .The results indicated that CARK 3 and RCAR12 were co-transfected into yeast and grew normally on the three-deficient plates ;CARK3 and RCAR12 showed a significant and single band ,which detected by His-Tag antibody .Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) was used to illuminate the in-teraction between CARK3 and RCAR12 in Nicotiana benthamiana in vivo .The result showed that CARK3 and RCAR12 were co-transfected into tobacco ,and a strong fluorescence was observed . We could confer that CARK3 indeed interacts with RCAR12 in present study and the phosphorylation modulates the physiological re -sponse of the core ABA signaling pathway .%植物激素ABA是植物应对非生物胁迫的响应因子,广泛参与了植物生长发育的调控.ABA结合其受体后抑制PP2Cs的磷酸酶活性,释放SnRK2s,从而启动ABA信号转导途径.本文采用酵母双杂交系统,GST-pull down技术研究蛋白质激酶CARK3与ABA受体RCAR12在体外的相互作用,结果显示CARK3和RCAR12共转入酵母后,在三缺平板上能够正常生长;经His-Tag抗体检测,CARK3与RCAR12出现明显且单一的条带.同时,采用双分子荧光互补实验研究CARK3与RCAR12在体内的相互作用,结果显示CARK3与RCAR12共转化烟草后能观察到较强的荧光.体内外实验表明,CARK3与RCAR12存在明显的相互作用,CARK3可能通过直接磷酸化ABA受体RCAR12来调控ABA信号途径的生理应答.

摘要： 目的:利用酵母双杂交系统,以149位赖氨酸突变成甲硫氨酸的c-Jun N端激酶激酶2(JNKK2)失活突变体(JNKK2KM)为诱饵,从人胎肝文库中筛选能与JNKK2作用的蛋白.方法:构建诱饵质粒pGBKT7-JNKK2KM,将其转化到AH109感受态酵母菌中进行扩增,而后检测融合蛋白表达、自激活活性以及对宿主的毒性;将诱饵酵母菌与含有人胎肝cDNA文库质粒的Y187交配进行酵母双杂交筛选,经缺陷型培养基筛选排除假阳性克隆;取阳性菌落抽提质粒进行酶切鉴定,对鉴定后的阳性克隆进行测序及生物信息学分析,明确筛选出的蛋白信息,通过免疫共沉淀实验验证筛选出的蛋白与JNKK2的相互作用.结果:构建了诱饵质粒,检测到融合蛋白的表达,且无自激活作用,未发现对宿主存在毒性;初步筛选到120个阳性克隆,经多轮重复验证得到阳性克隆11个,经生物信息学分析最后确定3个可以与JNKK2相互作用的新蛋白质分子为鸟嘌呤核苷酸结合蛋白β多肽2样蛋白1(GNB2L1)、开放读框60(ORF60)与泛素样修饰物激活酶3(UBA3),免疫共沉淀实验表明它们均能与JNKK2发生相互作用.结论:筛选到3个新的JNKK2相互作用蛋白,为深入探究JNKK2在肝脏中的作用奠定了基础.

摘要： 目的：筛选与乙型流感病毒BM2蛋白相互作用的蛋白质。方法：应用酵母双杂交系统,以BM2(26-109)插入载体PGBKT7作为诱铒，在四缺培养基上筛选人Kidney MATCHMAKERcDNA文库，寻找与BM2蛋白相互作用的宿主蛋白。结果：筛选得到6个阳性AD/文库质粒，并用酵母双杂交实验验证了阳性AD/文库质粒与BM2的相互作用。将阳性AD/文库质粒测序并对测序结果做BLAST分析，发现它们分别是N-乙酰神经氨酸酶丙酮酸裂解酶，Angiopoie曲3、锌指蛋白251、核糖体蛋白S20、蛋白精氨酸N-甲基转移酶1(PRMT)、转录因子样1(TCFLI)。结论：BM2能与这些转录翻译功能相关的蛋白质相互作用，表明BM2蛋白在病毒生活周期中发挥重要作用。

摘要： 本研究通过酵母双杂交系统筛选得到与新城疫病毒M蛋白相互作用的8种细胞蛋白，并在酵母细胞中初步验证彼此的相互作用。指出，与M蛋白相互作用蛋白的鉴定，为深入研究M蛋白在细胞核内的功能以及在病毒复制、装配和释放过程中的作用机制奠定了基础。

摘要： 生长抑制因子(growth ynhibitory factor,GIF),又称金属硫蛋(metallothionein-3,MT-3)特异地分布于脑组织,在与Alzheimer's病脑提取物共存的情况下,对神经细胞的生长具有明显的抑制作用.提示GIF可能是Alzheimer's病相关的因子.为了探索GIF在神经生理活动中的作用和阐明与Alzheimer's病因的关系,以GIF为诱饵基因,构建诱饵质粒pHyblex-GIF(baitl),应用酵母双杂交系统,对人脑cDNA交库进行了4.6*106个酵母转化子的筛选;得到12个较强的双阳性(His+lacZ)酵母克隆.对阳性酵母中的文库质粒进行DNA序列分析和网上DNA序列同源检索,结果表明其中4个阳性文库质粒的插入片段分别编码:线粒体细胞色素c氧化酶亚基II、线粒体ATP合成酶α亚基、细胞核dUTPase和G-蛋白Rab3a的部分蛋白序列. 经聚合酶链式反应(PCR)得到包含蛋白全编码区的Rab3a cDNA和核dUTPase cDNA.双杂交系统实验表明,完整的Rab3a可与GIF相互作用.此外,我们还将Rab3a cDNA克隆于原核融合表达载体pGEX-4T-1,在大肠杆菌BL21中进行了诱导表达和纯化.

摘要： 本文将主要从路径依赖、机会的把握以及资本推动等几个方面重新诊释酵母双杂交技术系统的技术与社会选择。这是之前SST理论一直忽略的，国内学者一直没有关于具体生物技术的微观文献类研究，大多处在宏观或者是对于科学家本身的实验室研究范畴，而对于具体技术的SST意义下的研究一直处于空白，国际上，对于生物技术的具体案例研究还是很多的，但是大多集中在使用伦理视角和女性主义视角来做出解读。本文试图从新的视角弥补国内关于具体生物技术研究在STS领域内的空白，也试图从技术的社会建构的角度去审视酵母双杂交这个技术选择的案例，从而引发国内科学社会学学界关于常规生物技术方面的思考和争鸣。

摘要： 由植原体引起的泡桐丛枝病分布于整个泡桐栽培区,遍及全国各地.泡桐丛枝病的发生使泡桐的长势减弱,导致木材质量下降,严重时导致病株死亡.植原体具有多型性,形态大小约为80～1000nm,基因组大小为500～1300kb之间,其DNA组成AT含量为75％左右.迄今对于植原体的致病机制及致病因子、寄主与病菌互作关系缺乏足够的认识.克隆与泡桐丛枝植原体的相关致病基因功能及研究其与寄主的相互作用和生物学具有重要的现实意义.本研究以泡桐丛枝植原体侵染后发病的泡桐组培苗ZD为材料，TRIZOL法提取植物总RNA,Oligotex kit吸附法分离纯化泡桐组培苗真核mRNA后，采用酵母双杂交系统，利用SMART技术，在酵母菌株AH109中构建感病泡桐组培苗cDNA酵母文库。结果表明，所构建的文库转化率为2×10-7，文库滴度为1.24×10-8pfu/ml，重组率100%，插入片段分布于300-3000bp,集中于750bp左右。因此，该文库为今后利用酵母双杂交方法，研究泡桐丛枝植原体相关致病基因和寄主的互作关系打下基础。

摘要： 微生物在自然界中的分布非常广泛,是生态系统的重要组成部分,对环境具有非常重要的作用。目前利用微生物来进行饮用水的处理已经是一种重要的水处理方法,因此研究水处理工艺中微生物的组成、结构和动态性,有利于了解和判断水处理工艺的运行状况,有利于掌握处理过程中微生物群落的变化规律,进而实现对水处理过程更为有效的控制与改进,最终实际地提高饮用水处理效率。本文介绍了酵母双杂交系统这一研究蛋白质相互作用的相对前沿的技术，以及它的制作过程和心得体会。

摘要： 目的：利用酵母双杂交系统从人胎脑cDNA文库中筛选与人巨细胞病毒UL135编码蛋白相互作用的蛋白。rn 方法：将成功构建的酵母诱饵表达载体pGBKT7-UL135转化到酵母菌AH109中，再将人胎脑文库DNA转化到含有pGBKT7-UL135的酵母细胞中，筛选与UL135编码蛋白相互作用的文库蛋白，对阳性克隆进行测序和生物信息学分析。rn 结果：最终确认多个克隆与UL135编码蛋白相互作用，其中2个克隆与Thy—1高度同源。rn 结论：成功应用酵母双杂交系统筛选出与人巨细胞病毒UL135编码蛋白相互作用的蛋白，其中Thy-1在人巨细胞病毒感染致病过程中可能起重要作用。

摘要： 本研究将鸭胚成纤维细胞传代两次，提取细胞总RNA;利用Clontech SMART技术，以LD-PCR合成双链cDNA;利用同源重组方法，将纯化后的双链cDNA在酵母细胞Y187内构建cDNA文库。结果表明，细胞总RNA的0D260nm／OD2802nm为2．0，文库容量达到5×106cfu，插入的双链cDNA的平均大小为0．65 Kb，文库的重组率为100％。该cDNA文库构建的成功，为筛选与小鹅瘟病毒结合的细胞蛋白奠定了基础。

摘要： 本研究将鸭胚成纤维细胞传代两次，提取细胞总RNA;利用Clontech SMART技术，以LD-PCR合成双链cDNA;利用同源重组方法，将纯化后的双链cDNA在酵母细胞Y187内构建cDNA文库。结果表明，细胞总RNA的0D260nm／OD2802nm为2．0，文库容量达到5×106cfu，插入的双链cDNA的平均大小为0．65 Kb，文库的重组率为100％。该cDNA文库构建的成功，为筛选与小鹅瘟病毒结合的细胞蛋白奠定了基础。

摘要： 本研究将鸭胚成纤维细胞传代两次，提取细胞总RNA;利用Clontech SMART技术，以LD-PCR合成双链cDNA;利用同源重组方法，将纯化后的双链cDNA在酵母细胞Y187内构建cDNA文库。结果表明，细胞总RNA的0D260nm／OD2802nm为2．0，文库容量达到5×106cfu，插入的双链cDNA的平均大小为0．65 Kb，文库的重组率为100％。该cDNA文库构建的成功，为筛选与小鹅瘟病毒结合的细胞蛋白奠定了基础。

摘要： 本发明公开了一种新的评估由无参考基因组物种构建的酵母双杂交文库质量的方法，该方法能够体现文库中插入基因数量、基因丰度等关键性指标，解决了传统的由无参考基因组物种构建的酵母双杂交文库质量评估方法的片面性，适合一般的实验室进行准确的文库评估。该方法通过文库15轮循环数的PCR扩增、产物回收之后的浓度测定和电泳情况初步判断，之后将回收产物进行高通量测序、de novo组装后详细分析，获得文库的插入基因数量、基因丰度等关键性指标，完成由无参考基因组物种构建的酵母双杂交文库质量的准确评估。同时，还能获得无参考基因组物种基因的序列信息，为下一步互作蛋白编码基因的克隆提供基础。

摘要： 本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种酵母双杂交文库构建方法专利申请事宜。该方法用于烟草基因组全长转录因子文库构建，具体包括：转录因子筛选及开放阅读框全长扩增引物设计、制备cDNA模板、PCR扩增、磷酸化处理、连接重组接头、构建全长转录因子的文库质粒、质粒转化并构建文库等步骤。本申请所提供全长转录因子酵母双杂交文库构建方法，是对现有构建方法的进一步综合性改进，具有转录因子阳性筛选率高、筛选准确性高、所构建文库质量高等优点，同时由于对于相关操作步骤有所优化，因而能够节省构建时间和构建成本，因此具有较好的实用价值和推广应用意义。

摘要： 本发明公开一种双杂交酵母及检测环境污染物类/抗盐皮质激素作用的方法，(1)构建含有pGBKT7‑MR酵母表达质粒和pGADT7‑TIF2酵母表达质粒的双杂交酵母；(2)将所得双杂交酵母与盐皮质激素标准品共培养，检测报告基因表达的酶的酶活性，以酶活性对盐皮质激素标准品浓度绘制标准曲线；(3)相同条件下将待测环境污染物与所得双杂交酵母共培养，将所得酶活性带入所述标准曲线中，计算所得的盐皮质激素标准品剂量即为环境污染物的类盐皮质激素剂量。本发明的目的在于构建一种能同时表达盐皮质激素受体和受体共激活因子的双杂交酵母，并在此基础上建立一种快速、经济的检测环境污染物对盐皮质激素受体干扰活性的生物测试方法。

摘要： 本发明适用于基因工程技术领域，提供了一种靶点特异性甲型流感病毒药物筛选酵母双杂交体系、系统及应用，该靶点特异性甲型流感病毒药物筛选酵母双杂交体系、系统包括甲型流感病毒PB1基因和PB2基因、PB1基因和PA基因、PB1和PB2及PA基因。利用该靶点特异性甲型流感病毒药物筛选酵母双杂交体系、系统的药物筛选具有特异性高、筛选通量高和目标药物作用机理明确的优点。

摘要： 本发明公开了一种高通量酵母双杂交文库筛选方法。属于分子生物技术领域。该方法包括如下步骤：酵母诱饵菌株的制备；酵母诱饵菌株与文库菌的杂交；交配后培养物的培养与检测：将交配后培养物置于半固态培养基中，冰上培养，使液态培养基凝固成半固态胶冻状，之后培养收集酵母细胞，并提取酵母细胞质粒进行PCR扩增，凝胶电泳检测。该方法采用半固态凝胶培养基培养来代替经典方法中涂板培养的步骤，缩减了工作量，也免去挑选单克隆进行检测时的大量重复操作。

摘要： 本发明公开了一种新的评估由无参考基因组物种构建的酵母双杂交文库质量的方法，该方法能够体现文库中插入基因数量、基因丰度等关键性指标，解决了传统的由无参考基因组物种构建的酵母双杂交文库质量评估方法的片面性，适合一般的实验室进行准确的文库评估。该方法通过文库15轮循环数的PCR扩增、产物回收之后的浓度测定和电泳情况初步判断，之后将回收产物进行高通量测序、de novo组装后详细分析，获得文库的插入基因数量、基因丰度等关键性指标，完成由无参考基因组物种构建的酵母双杂交文库质量的准确评估。同时，还能获得无参考基因组物种基因的序列信息，为下一步互作蛋白编码基因的克隆提供基础。

摘要： 本发明涉及生物技术领域，特别涉及酵母双杂交载体、构建方法及其在蛋白互作中的应用。该酵母双杂交载体包括：pNC‑GADT7载体和pNC‑GBKT7载体；所述pNC‑GADT7载体于pGADT7载体的克隆位点处插入Nimble Cloning克隆框；所述pNC‑GBKT7载体于pGBKT7载体的克隆位点处插入Nimble Cloning克隆框。该Nimble Cloning的酵母双杂交载体，以方便目标基因克隆到载体。具有操作简单、克隆效率高、可标准化克隆等优点。

摘要： 一种用于高通量受体基因筛查的新型膜蛋白酵母双杂交方法。本发明公开了一种膜外酵母双杂交系统及其应用，所述系统包括钓饵表达载体和猎物表达载体，所述钓饵表达载体包括钓饵表达单元序列，所述钓饵表达单元序列是将分泌信号肽编码基因序列、跨膜肽编码基因序列中的至少一种与钓饵编码基因序列以及胞内效应蛋白结构域编码基因序列融合后获得，所述猎物表达载体包括猎物表达单元序列，所述猎物表达单元序列是将分泌信号肽编码基因序列、跨膜肽编码基因序列中的至少一种与猎物编码基因序列以及胞内效应蛋白结构域编码基因序列融合后获得或者所述猎物表达单元序列是将猎物编码基因序列以及胞内效应蛋白结构域编码基因序列直接融合后获得。所述系统可用于研究发生在细胞膜外侧的蛋白相互作用。

摘要： 本发明涉及膜蛋白实验技术领域，且公开了一种基于膜体系‑酵母双杂交发现膜蛋白的方法，一种基于膜体系‑酵母双杂交发现膜蛋白的方法，包括以下材料诱饵克隆：pBT3‑STE‑A、诱饵载体：pBT3‑STE、文库酵母质粒：草膜文库、Clontech酵母双杂交系统、培养基、贮备液。该基于膜体系‑酵母双杂交发现膜蛋白的方法，通过将诱饵质粒转化受体菌NMY51中及其自激活检测、文库筛选、筛库结果、酵母阳性克隆鉴定及测序比对与测序比对结果、酵母阳性克隆鉴定及测序比对与测序比对结果、酵母阳性克隆回转验证等步骤，通过酵母阳性克隆回转验证将筛选得到的34个酵母阳性克隆，均能在SD‑TL、SD‑TLH+30mM 3AT、SD‑TLHA+30mM 3AT缺陷性平板上生长，从而得到最终的膜蛋白，解决了与pBT3‑STE‑A作用的蛋白不易发现的问题。

摘要： 本发明涉及发酵酵母筛选基因技术领域，且公开了一种酵母双杂交筛选多肽文库的实验方法，包括材料的准备，所述材料的准备包含有诱饵克隆pGBKT7‑gA9‑nosc‑221、诱饵载体pGBKT7、文库酵母质粒pGADT7‑多肽cDNA、Clontech酵母双杂交系统、培养基的准备，所述培养基的准备包含有大肠杆菌培养基、酵母完全培养基、酵母缺陷型筛选培养基以及其他贮备液。具体包含将诱饵质粒转化受体菌AH109中及其自激活检测、文库筛选、酵母阳性克隆鉴定及测序比对、酵母阳性克隆回转验证，以构建到pGBKT7载体上的gA9‑nosc‑221基因为诱饵，筛选酵母双杂交多肽文库，经过对阳性克隆的多重报告基因检测、DNA测序和BLAST比对分析，确定与pGBKT7‑gA9‑nosc‑221相互作用的多肽，该确定多肽蛋白的方法更加高效，大大提高了研究的效率。