转染效率

摘要： 研究旨在提高miRNA模拟物在奶牛子宫内膜原代上皮细胞的转染效率。应用带有FAM标记的miRNA-185 mimics为报告基因,检测两种不同转染试剂(Lipofectamine RNAiMAX与Lipofectamine 2000)在细胞接种12、18、24 h后的转染效率,采用Q-PCR法检测最佳转染条件下试验组与对照组miRNA-185的表达变化。结果显示,无论使用Lipofectamine 2000还是Lipofectamine RNAiMAX作为奶牛子宫内膜原代上皮细胞的转染试剂,各组间12 h的转染效率均极显著高于18、24 h(P<0.01),18 h的转染效率均极显著高于24 h(P<0.01);Lipofectamine RNAiMAX各时间点的转染效率均极显著高于Lipofectamine 2000(P<0.01)。使用Lipofectamine RNAiMAX作为奶牛子宫内膜原代上皮细胞的转染试剂时,12 h的荧光强度极显著高于18、24 h(P<0.01),24 h的荧光强度极显著高于18 h(P<0.01),Lipofectamine RNAiMAX各时间点的荧光强度均极显著高于Lipofectamine 2000(P<0.01)。检测Lipofectamine RNAiMAX在细胞接种12 h转染后miRNA-185表达量,发现与对照组相比,试验组miRNA-185的表达极显著升高(P<0.01)。研究表明,奶牛子宫内膜原代上皮细胞适合应用脂质体进行miRNA化学合成模拟物的转染,当选用Lipofectamine RNAiMAX作转染试剂,细胞接种12 h后转染可达最佳的转染效果。

摘要： 为了构建真核重组荧光质粒pEGFP-N1-Et HP,并筛选出Lipofectamine 2000介导的高效转染细胞,本试验将柔嫩艾美尔球虫假定蛋白(Et HP)基因扩增后插入真核荧光表达载体pEGFP-N1,构建真核重组荧光质粒pEGFP-N1-Et HP;测序成功后,用Lipofectamine 2000介导pEGFP-N1-Et HP转染4种细胞即Vero、DF-1、BHK、HD-11;用Western blot检测确定Et HP蛋白在4种细胞内的表达,并观察转染48 h后荧光表达情况,计算5个视野内带有绿色荧光的细胞数占细胞总数的比例,从而比较质粒与Lipofectamine 2000比例不同时4种细胞的转染效率[转染效率/%=(带有绿色荧光的细胞数/细胞总数)×100%]。测序结果显示,pEGFP-N1-Et HP构建成功。Western blot检测显示,Et HP蛋白在4种细胞中均成功表达;荧光显微镜观察到4种细胞转染后48 h均出现绿色荧光,表明重组质粒pEGFP-N1-Et HP成功表达。通过转染效率的比较,发现DF-1细胞转染效率均显著高于其他细胞(P<0.05);当质粒与Lipofectamine 2000比例为1∶2时,DF-1细胞转染效率最高。因此,重组质粒pEGFP-N1-Et HP可高效转染DF-1细胞。本试验结果为进一步探索Et HP蛋白在柔嫩艾美尔球虫入侵寄生过程中的生物学功能提供有效的试验工具。

摘要： 通过构建载体/基因/蛋白共递送复合体系,探讨了阳离子聚合物聚乙烯亚胺(PEI,25 kDa)负载基因和蛋白在细胞中共递送的效率。实验采用凝胶阻滞电泳确定了聚乙烯亚胺与蛋白、基因形成稳定复合物的最佳质量比为2∶1∶0.05。激光扫描共聚焦成像结果表明,聚乙烯亚胺可以有效递送Cy5-pDNA和FITC-BSA进入细胞。通过β-半乳糖苷酶(β-Gal)原位染色法、Western blot和Caspase-3活性检测实验,进一步分析了递送蛋白β-Gal的活性和p53基因的转录翻译功能。结果显示,PEI介导递送的β-Gal保持了较高的酶活性,可以有效催化底物的分解。共负载p53基因转染细胞后,p53蛋白表达水平显著上调且可以激活p53蛋白相关信号通路中关键性激酶Caspase-3。

摘要： 聚乙烯亚胺(Polyethyleneimine,PEI)是一类基因转染用阳离子聚合物,PEI转染效率较好但具有细胞毒性。使用含氟化合物对阳离子聚合物进行修饰可以有效提高其基因转染效率,降低毒副作用。本研究,我们对PEI进行氟化修饰并探索氟化PEI的修饰及转染比例对PC3细胞转染效率的影响。结果表明,所得氟化PEI转染效率优于商业化转染试剂Lipo3000。

摘要： 聚乙烯亚胺(Polyethyleneimine,PEI)是一类基因转染用阳离子聚合物,PEI转染效率较好但具有细胞毒性.使用含氟化合物对阳离子聚合物进行修饰可以有效提高其基因转染效率,降低毒副作用.本研究,我们对PEI进行氟化修饰并探索氟化PEI的修饰及转染比例对PC3细胞转染效率的影响.结果表明,所得氟化PEI转染效率优于商业化转染试剂Lipo3000.

摘要： 主链含二硫键的聚酰胺胺因具有良好的生物可还原性和低细胞毒性,从而成为基因递送研究的热门载体.这类载体经阴离子基团、胍基、咪唑等官能团修饰后,结构和性能有很大改变,如DNA凝聚能力、细胞转染能力等.本文重点介绍经功能化修饰的生物可还原性聚酰胺胺对基因传递的影响,并对聚酰胺胺的结构修饰策略进行详细综述.

摘要： 聚乙烯亚胺(PEI)是一种被广泛使用的非病毒类基因转染载体。但这类高分子材料在基因传递中的存在细胞毒性大，转染效率低等问题。氟烷基链既疏水又疏油，使用含有氟烷基链的化合物对高分子进行氟化修饰可以有效地提高其基因转染效率并降低其毒副作用。本文通过将PEI与含有氟烷基链的环氧化物或酸醉反应得到6种氟化修饰的PEI。氟化修饰的PEI在普通细胞系和3D细胞系上都表现出比未经修饰的PEI更高的基因转染效率。本研究得到了一系列在2D和3D细胞系上具有较高基因转染效率和较低毒性的基因转染载体，同时也证明了氟化修饰是提高高分子载体基因转染效率的一种有效的策略.

摘要： 在本文中，研究了微泡的惯性空化(IC)对bPEI影响下的DNA转染效率的增强效应，使得利用较低水平的N/P比率来达到较优化的转染效率成为可能。通过本文研究，可证实ICD随超声驱动强度的增加而增加。增加ICD可产生大的声穿孔孔洞，从而使得更多的DNA进入细胞。因为微泡惯性空化的毒性比bPEI的毒性小，通过选择适当的超声参数，可以利用超声驱动下微泡空化效应和相对低的N/P比来达到bPEI:VEGF的基因转染效率优化效果。

摘要： 阳离子聚合物作为理想的非病毒基因载体,具有较低的免疫原性和较高的核酸负载能力,并且易于制备方便修饰等.市售的现成的阳离子聚合物仍然面临血清稳定性、细胞摄取、内含体逃逸等等障碍.因此尝试通过修饰阳离子聚合物使它们得以突破转染障碍,提高转染效率.设计合成了两种芳香型氨基酸（色氨酸和苯丙氨酸）以及一种脂肪型氨基酸（亮氨酸）修饰的低分子量聚乙烯亚胺，并考察不同氨基酸修饰及不同修饰度对转染效率的影响。

摘要： 对于不含氟阳离子聚合物基因载体来说,较高的转染效率往往会引起更高的细胞毒性.相反地,氟原子的引入可以赋予阳离子聚合物载体某些特殊的物理化学性质,如增强核酸的压缩能力、提高血清稳定性、促进细胞摄取和内涵体/溶酶体逃逸等.除此之外,由于氟化阳离子聚合物载体在较低的用量下可以实现较高的转染效率,因此还具有高效低毒的特性.该研究通过环氧开环聚合方法交联小分子PEI合成了一系列含氟阳离子聚合物基因载体。在后续构效关系的研究过程中，发现氟原子有利于增强聚合物与DNA间的静电相互作用，并形成稳定性更好的复合物。但更加稳定的复合物不利于DNA在细胞中的有效释放，进而可能会降低转染效率。体外实验结果表明，在较低的质量比下，含氟聚合物可以有效介导核酸在2D和3D细胞培养中的转染，且含氟聚合物-核酸复合物的细胞毒性很低。血清稳定性实验结果表明氟原子可以增强复合物的血清稳定性，总之，该研究可以为设计高效低毒的含氟阳离子聚合物载体提供一条新的策略。

摘要： 研究经脂质体转染CLEC9A基因,构建过表达CLEC9A的大鼠树突状细胞及DC2.4细胞,并检测树突状细胞功能和性质的变化。结果表明脂质体对贴壁生长的DC2.4细胞的转染效率高于半悬浮生长的DC细胞;转染浓度为3μg:9μl的质粒-脂质体复合物转染效率更高;贴壁生长的DC2.4细胞株虽然能传代，但缺乏正常DC细胞表面高表达的分子，如CD80,CD83,CD86和MHC Ⅱ，虽然脂质体转染效率很高，但在肿瘤抗原刺激后，表面分子的表达量并未有相应地明显增加;CLEC9A的表达量增多可增强DC细胞的活性和功能，有一定的临床应用前景。

摘要： 本文运用Crispr/Cas9技术在HEK293T细胞中敲除DNA甲基转移酶3a(DNMT3a)基因,并成功获得了一株完全敲除DNMT3a的细胞株HEK293T-KO.为了研究DNMT3a敲除对细胞表达重组蛋白的影响,以GFP作为模式蛋白,在HEK293T-WT和-KO细胞株分别转染表达EGFP的质粒,观察并比较转染效率和蛋白表达水平.结果显示,细胞中敲除DNMT3a基因会严重影响细胞的生长;并且与野生型细胞株相比,HEK293T-KO细胞株的转染效率显著降低;进一步采用流式细胞术检测转染48h之后GFP的荧光强度作为细胞平均GFP表达量的指标,发现敲除细胞株的平均绿色荧光强度也显著低于野生型细胞株.数据说明DNMT3a对外源蛋白在HEK293T细胞中的表达具有重要作用.

摘要： 在制备转基因克隆羊的研究中,如何提高阳离子脂质体介导基因转染羊成纤维细胞效率问题成为了目前研究的热点.本文首先介绍了阳离子脂质体类型，其次介绍了质粒的浓度、纯度和构型，然后介绍了细胞的生长状态和汇合度对转染效率也起着非常重要的作用，如果细胞汇合度低于40%或者高于80% ,其转染效率都会有所下降，介绍了脂质体与DNA的比例及转染时间，将超声波技术和脂质体转染技术有效地结合起来，不仅能明显的提高脂质介导的基因转染效率，还能增强基因转染的特异性，介绍了培养基中的血清和抗生素，不同脂质体转染效率差异很大，且每种脂质体对于不同种类细胞和同种类不同密度的细胞都有不同的转染条件。过高的脂质体对细胞有一定的毒性，过低反而影响转染效率。只有在细胞接种量、脂质体量、DNA量以及脂质体一DNA复合物与细胞作用时间达到最佳搭配时，才能获得最高的转染效率。

摘要： 目的:采用反向转染法观察siRNA在心脏成纤维细胞的转染效率和持续时间.方法:应用Invitrogen公司的绿色荧光素标记的阳性对照siRNA和Lipofectamine RNAiMAX转染试剂反向共转染大鼠心脏成纤维细胞后，在荧光倒置显微镜下观察不同siRNA转染浓度和不同转染时间时心脏成纤维细胞的绿色荧光强度和荧光表达率，从而评价siRNA的转染效率和持续时间。结果：反向转染后在荧光倒置显微镜下进行明场和绿色荧光暗场对照观察并计数细胞。空白对照组和单纯转染试剂组，在各时间点的明场两组间心脏成纤维细胞的数量无明显差异，表明Lipofectamine RNAiMAX转染试剂对细胞毒性较低;在绿色荧光暗场均未观察到带荧光的细胞，说明siRNA转染具有特异性。siRNA反向转染后6小时可在部分心脏成纤维细胞的胞质和胞核观察到明显的绿色荧光，24小时细胞质和胞核内的绿色荧光强度最强，48小时荧光强度开始降低，72小时荧光强度明显降低，到96小时荧光强度已很微弱。在6小时时间点随着siRNA转染浓度的增加，心脏成纤维细胞的转染效率明显增加。在12小时、24小时、48小时和72小时各时间点，低浓度组间转染效率变化明显，而高浓度组间转染效率变化不明显。结论:siRNA反向转染法对大鼠心脏成纤维细胞有较高的转染效率和较小的细胞毒性。

摘要： 随着对基因组信息解读的不断深入,越来越多的生物大分子作为候选药物进入了分子治疗领域,但由于细胞膜的屏障作用使大多数生物大分子难于进入细胞内部发挥效能.细胞膜穿透肽(CPP)是一类能穿透细胞胞膜和/或核膜的短肽并能引导所携带的蛋白质、核酸甚至纳米颗粒等进入细胞(核)内.作为一种全新的非病毒药物载体,以其安全、易于组装等诸多优点被寄予厚望.但是迄今研究用CPPs数量有限、穿膜效率不理想,亟需探索开发更多、更好的CPPs以提高其载药效率和应用范围.近年来在CPP开发及应用方面进行了一些尝试,诸如探索和优化CPP的穿膜条件,CPP的靶向及穿膜效应,CPP介导的DNA转染效率,以及设计开发新的CPP等.对CPP的深入研究将为推广基因工程蛋白药物的应用和基因治疗研究提供新兴载药工具.

摘要： 基因载体是将外源核酸载入细胞内的重要工具,开发高效安全的非病毒基因载体对基因治疗意义重大.脂质体是最早被用作基因载体将外源性基因导入宿主细胞内的非病毒基因载体.

摘要： 本发明属于生物医用高分子材料领域，公开了一种细胞毒性低、转染效率高的非病毒基因转染载体材料及其制备方法与应用。本发明载体材料结构如通式(1)所示：

摘要： 本发明公开了一种提高转染效率的表达载体pEGFP‑N1‑p53/MAR、构建方法及转染方法，该表达载体pEGFP‑N1‑p53/MAR将人抑癌基因p53和鸡的核基质附着区MAR基因插入表达载体中构建而成。本发明通过RT‑PCR和PCR法分别从早期肺癌病人的外周血和鸡的肝脏组织中获取人抑癌基因p53和鸡的调控序列MAR，通过酶切、连接、转化等手段构建含有EGFP基因的真核重组表达载体pEGFP‑N1‑p53/MAR。同时，本发明将表达载体pEGFP‑N1‑p53/MAR转染鸡胚盘，结果发现本发明的转基因鸡孵化率达到56.4％。在成活的转基因鸡只中有7只检测出了目的基因p53条带的存在，阳性检测率为18.9％。

摘要： 本发明提供了一种提高基因载体转染效率和/或转染精度的转染辅助试剂及其应用，所述转染辅助试剂包括聚乙二醇和/或其衍生物。本发明创造性地利用聚乙二醇作为辅助试剂进行基因转染，发现：(1)聚乙二醇或其衍生物可显著提高基因载体对体外细胞的转染效率，其中包括一些基因载体无法转染的细胞；(2)聚乙二醇或其衍生物可显著提高基因载体对活体组织的转染效率，并促进基因载体在活体组织中局域表达，从而在目标组织中实现高效、精准转基因表达；(3)聚乙二醇或其衍生物可长期促进基因载体高效、精准转染活体组织，并不会在活体组织中引发显著的副作用，例如细胞凋亡、严重的免疫反应、动物行为功能显著改变。

摘要： 本申请涉及基因转染的技术领域，具体公开了一种提高瞬时转染效率的转染试剂及转染方法。转染试剂包括PEI转染试剂和DMSO；其转染方法包括以下步骤：S1、准备转染质粒、细胞培养液（用1~5%(v/v)的DMSO处理5~10 h）；将转染试剂和培养基混合得到PEI混合液，其中转染试剂中添加有0.5%~1%(v/v)的DMSO，将转染质粒和培养基混合得到质粒DNA混合液；S2、将所述PEI混合液加入至质粒DNA混合液，室温孵育，得到DNA‑PEI复合物混合液；S3、将DNA‑PEI复合物混合液加入至所述细胞培养液中，并培养数天。本申请的转染试剂和转染方法用于细胞转染，其具有转染效率高的优点。

摘要： 本发明提供了一种可以提高难转染干细胞转染效率的方法。我们之前的研究中发现一类骨髓间充质干细胞（BMSCs）之所以转染效率低主要是由于被摄入物质难以从它的囊泡中逃逸出来。我们提供了一种解决在BMSCs中囊泡逃逸难的问题的方法，进而提高BMSCs转染效率，可以被广泛应用于干细胞工程、蛋白质治疗和基因治疗等领域。

摘要： 本发明提供了一种提高病毒转染移植静脉组织效率的组合物，该组合物包括温度敏感型原位凝胶，其低温时为自由流动的液体，温度升高时形成凝胶。包含温度敏感型原位凝胶和目的基因的病毒以凝胶状态包裹在血管组织周围，能够持续释放病毒，增加术后血管组织与病毒的接触时间，提高病毒的转染效率。该组合物中还可以包含胰蛋白酶，增加血管的通透性，有利于病毒通过血管外膜进入组织。同时，本发明还提供了一种转染移植静脉组织的方法，该方法简单、稳定、便于操作。本发明提供的组合物应用于移植静脉再狭窄局部基因治疗中，能够提高携带目的基因病毒转染移植静脉组织的效率。并且该组合物能够显著提高腺相关病毒6血清型转染移植静脉血管组织的效率。

摘要： 本发明属于生物医用高分子材料领域，公开了一种细胞毒性低、转染效率高的非病毒基因转染载体材料及其制备方法与应用。本发明载体材料结构如通式(1)所示：

摘要： 本发明提供了一种将miRNA转染进猪精子并评估其转染效率的方法，主要步骤为：将稀释后的新鲜猪精液45度立于CO2培养箱中孵育1小时；用巴氏吸管吸出适量上层精子悬浮液；离心浓缩精子后加入等体积稀释液进行稀释；通过X‑tremeGENE siRNA Transfection转染试剂将miRNA转染进精子，将其放置在17°C保温箱上，转染6小时；通过离心沉淀精子，并使用Trizol LS抽提精子中的Total RNA；对抽提出的Total RNA进行miRNA反转以及相关miRNA的定量。该发明有利于日后进行精子转染miRNA的研究实验。

摘要： 本发明公开了一种提高转染效率的表达载体pEGFP-N1-p53/MAR、构建方法及转染方法，该表达载体pEGFP-N1-p53/MAR将人抑癌基因p53和鸡的核基质附着区MAR基因插入表达载体中构建而成。本发明通过RT-PCR和PCR法分别从早期肺癌病人的外周血和鸡的肝脏组织中获取人抑癌基因p53和鸡的调控序列MAR，通过酶切、连接、转化等手段构建含有EGFP基因的真核重组表达载体pEGFP-N1-p53/MAR。同时，本发明将表达载体pEGFP-N1-p53/MAR转染鸡胚盘，结果发现本发明的转基因鸡孵化率达到56.4％。在成活的转基因鸡只中有7只检测出了目的基因p53条带的存在，阳性检测率为18.9％。

摘要： 本发明属于生物医药技术领域，通过使用一种通过细胞释放的纳米粒子NONPs来提高基因转染效率。该种纳米粒子广泛存在于生物体系以及细胞外的循环系统中，例如支气管肺泡灌洗液、体液、血液、唾液、牛奶或者尿液中。本发明将上述纳米粒子掺入非病毒基因转染载体，可以显著增加基因转染载体的DNA负载能力，同时又不会增加细胞毒性。经实验结果表明，从牛奶中提取的NONPs，掺入PEI基因转染载体，可在几乎不增加细胞毒性的情况下，显著提高基因转染效率。本发明的主要用途为基因转染试剂，可用于细胞生物学研究、生产基因转染制剂以及基因疗法等。