二重PCR

摘要： 为筛选和建立准确、快速、敏感的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)检测方法,根据BVDV基因序列高度保守的5'UTR区,合成1对特异引物,从疑似BVDV感染的个体牛血清中提取RNA作为模板,采用二重PCR方法,获得252 bp特异性扩增产物,以此鉴别是否感染BVDV.结果表明,用该方法对同一牛场混合血清样品进行检测,发现该牛场存在BVDV感染.实验证明,该方法检测牛群是否感染BVDV,简单、快速、灵敏,且经济、方便、实用,在牛群BVDV检疫中具有较好的实用价值.

摘要： 为能快速灵敏的检测羊捻转血矛线虫病,试验采用微卫星DNA分子标记对羊捻转血矛线虫进行二重PCR扩增.对反应条件和体系的优化,筛选出2组可用以鉴定羊捻转血矛线虫的微卫星DNA组合.结果表明:PCR条带清晰、与预期片段大小吻合.试验建立了快速准确识别羊捻转血矛线虫的分子鉴定方法,为羊捻转血矛线虫病的快速检测和诊断提供依据.

摘要： 在建立单重PCR的基础上成功建立了多种二重PCR体系,以同时检测2种肉源成分(猪、牛、鸡和羊).PCR扩增的是每种动物的线粒体基因,由于鸡、羊的PCR扩增片段大小过于接近(131和119 bp),电泳图上不易区分,故试验中的二重PCR体系使用了5种动物组合.所建立的二重PCR方法能够迅速、稳定地同时鉴别2种肉源性成分,为下一步建立三重或四重PCR方法奠定了良好的基础.

摘要： 在建立单重PCR的基础上成功建立了多种二重PCR体系,以同时检测2种肉源成分(猪、牛、鸡和羊)。PCR扩增的是每种动物的线粒体基因,由于鸡、羊的PCR扩增片段大小过于接近(131和119 bp),电泳图上不易区分,故试验中的二重PCR体系使用了5种动物组合。所建立的二重PCR方法能够迅速、稳定地同时鉴别2种肉源性成分,为下一步建立三重或四重PCR方法奠定了良好的基础。

摘要： 目的 建立一种能同步检测鉴定海分枝杆菌和溃疡分枝杆菌的二重PCR方法,为手部及皮肤软组织感染海分枝杆菌和溃疡分枝杆菌早期诊断、早期治疗服务.方法 通过GeneBank数据库和文献查找海分枝杆菌和溃疡分枝杆菌的特有基因序列,设计2对能扩增海分枝杆菌和溃疡分枝杆菌特有序列的引物,建立能同步检测鉴定海分枝杆菌和溃疡分枝杆菌的二重PCR,特异性及敏感性.并初步应用该二重PCR检测鉴定19份临床考虑上肢感染NTM的标本.结果 本研究成功地建立能同步检测鉴定海分枝杆菌和溃疡分枝杆菌的二重PCR,扩增产物的长度海分枝杆菌为429 bp,溃疡分枝杆菌为240 bp,检测其他非结核分枝杆菌时未出现阳性条带,敏感性试验最低可检测出0.508 pg/μl海分枝杆菌,44.8 fg/μl溃疡分枝杆菌.检测鉴定19份临床标本,42.1％(8份)为海分枝杆菌感染,15.8％(3份)为溃疡分枝杆菌感染,42.1％(8份)未检出病原菌.结论 本研究建立的二重PCR可早期、快速地诊断手部及皮肤软组织感染海分枝杆菌和溃疡分枝杆菌,为临床制定最佳治疗方案提供一定依据.%Objective To establish a duplex PCR method that can synchronously detect and identify Mycobacterium marinum and Mycobacterium ulcerans in order to detect and treat soft tissue infections of the arms and skin from these mycobacteria at an early stage. Methods The specific gene sequences for Mycobacterium marinum and Mycobaterium ulcerans were searched from the GeneBank and the available literature, and NCBI/Primer-BLAST software and MFEPrimer-2.0 software were utilized to design two pairs of primers that could amplify the specific gene sequences of Mycobacterium marinum and Mycobacterium ulcerans. A duplex PCR was to be established to synchronously detect and identify Mycobacterium marinum and Mycobacterium ulcerans, and its optimal annealing temperature, specificity and sensitivity were explored. Then this duplex PCR was preliminarily applied to identify 19 specimens of clinically-considered non-tuberculosis mycobacteria infections (NTM) of the upper limbs. Results This study successfully established a duplex PCR that can synchronously detect and identify Mycobacterium marinum and Mycobacterium ulcerans. The length of amplified product of Mycobacterium marinum was 429 bp and that of Mycobacterium ulcerans was 240 bp at an optimal annealing temperature of 62.7°C . Positive bands did not appear when other NTM were detected. The lowest detectable level was 0.508 pg/μl for Mycobacterium marinum, and 44.8 fg/μl for Mycobacterium ulcerans. In the 19 clinical specimens, Mycobacterium marinum infection was detected and identified in 8 (42.1％), Mycobacterium ulcerans in 3 (15.8％) and pathogenic bacteria were not detected in 8 (42.1％). Conclusions The duplex PCR established in this study can quickly diagnose Mycobacterium marinum and Mycobacterium ulcerans infections of the soft tissue of the arms and skin at an early stage, providing a basis for clinical formulation of the optimal treatment plan.

摘要： 为建立猪肺炎支原体与猪鼻支原体的鉴别诊断方法,对从河南省及周边地区猪场采集的患呼吸道疾病的猪只样品进行支原体的分离培养,针对猪肺炎支原体与猪鼻支原体设计了2对引物,扩增片段大小分别为480 bp和360 bp,对所分离纯化的病原微生物进行了菌落形态观察及分子鉴定.结果显示,分离的病原微生物为支原体,菌落呈典型的“煎蛋样”特征;通过单一PCR扩增反应,分别得到了猪肺炎支原体与猪鼻支原体相应的目的扩增片段.表明分离到了猪肺炎支原体与猪鼻支原体.在单一扩增的基础上,建立了猪肺炎支原体与猪鼻支原体二重PCR反应方法,可同时得到2条目的条带,与单一PCR扩增结果一致.表明建立的二重PCR方法可用于猪肺炎支原体与猪鼻支原体的同时检测和鉴别诊断.%In order to develop differential diagnosis method of Mycoplasma hyosynoviae and Mycoplasma hyorhinis,Mycoplasma was isolated and identified from Henan province and surrounding areas.Two pairs of primers were designed to amplify Mycoplasma hyosynoviae and Mycoplasma hyorhinis DNA and the fragment sizes were 480 bp and 360 bp respectively.The results showed that the colony was a typical "fried egg" characteristic.The single amplified PCR showed that the isolated microbes were Mycoplasma hyosynoviae and Mycoplasma hyorhinis.On the basis of single amplification,the double PCR reaction was established for detecting Mycoplasma hyosynoviae and Mycoplasma hyorhinis.The double PCR method could be used for detection and differential diagnosis of Mycoplasma hyosynoviae and Mycoplasma hyorhinis.

摘要： 为建立一种能同时鉴别诊断禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)和鸡细小病毒(chicken parvovirus,ChPV)的检测方法,本研究根据GenBank中AIV 的M基因和ChPV 的NS基因保守序列,分别设计并筛选出两对特异性引物,用于AIV和ChPV的检测.通过优化反应条件,建立了AIV和ChPV二重PCR检测方法.试验结果表明,该方法特异好,能同时检测AIV和ChPV,对其他常见的禽病病原体均未反应;该法对AIV和ChPV的检测下限均为100 fg;对159份临床样品检测结果与PCR阳性产物测序结果一致.本研究建立的AIV和ChPV二重PCR检测方法具有特异性好、灵敏度高的特点,对 AIV 和ChPV的防制具有重要意义.%In order to establish a method to simultaneously detect avian influenza virus (AIV) and chicken parvovirus (ChPV),two pairs of specific primers were designed according to the sequences of AIV M gene and ChPV NS gene in GenBank.The duplex PCR assay was established by optimizing the reaction conditions.The tests showed that this method had high specificity, could simultaneously detect AIV and ChPV and no specific band was amplified for other subtypes avian pathogenic virus.The sensitivity result showed that the lower detection limit of this method was 100 fg.The results of 159 clinical samples were consistent with the sequencing results of PCR positive product.The double PCR methods for detection of AIV and ChPV established in this study had the characteristics of good specificity and high sensitivity, which was of great significance to the prevention control of AIV and ChPV.

摘要： A duplex PCR assay for detecting both chicken parvovirus (ChPV)and avian reoviruses (ARV) was developed to provide technical support for effective control of ChPV and ARV.According to the con-served gene sequences of ChPV NS1 and ARVσC in GenBank,two sets of specific primers were designed. The duplex PCR for simutaneous detection of ChPV and ARV was established by optimizing the reaction conditions.The optimized PCR reaction system was 2×PCR Mix 12.5 μL,of which sense primer and anti-sense primer of ChPV and ARV was 1.0 μL each.The mixed template was 2.0 μL and added to 25.0 μL with ddH2 O.The optimal reaction procedure was 95 °C initial denaturation for 5 min;95 °C degeneration for 1 min,56.1 °C annealing for 1 min,72 °C for 1 min in 35 cycles;72 °C extension for 10 min.The result indicated that the duplex PCR assay successfully amplified 204 bp for ChPV,405 bp for ARV.The sensitiv-ity of the assay was 58 fg for ChPV and 53 fg for ARV,but it was not sensitive to other chicken pathogens, such as Newcastle disease virus,H9 subtype avian influenza virus,Marek′s disease virus,infectious bron-chitis virus,infectious laryngotracheitis virus.The results detected by the duplex PCR had a 94% coinci-dence rate with the results detected by single PCR for the ChPV and ARV respectively.The duplex PCR assay is a quick,sensitive and specific test for detection of ChPV and ARV.%建立可同时检测鸡细小病毒（Chicken parvovirus，ChPV）与禽呼肠病毒（Avian reovirus，ARV）的二重 PCR 方法，为防控 ChPV 与 ARV 提供技术支撑。根据鸡细小病毒 NS1基因和禽呼肠病毒σC 基因的保守序列，设计合成两对引物用于检测 ChPV 和 ARV，通过优化二重 PCR 的反应体系，特异性、敏感性试验评价建立的 ChPV 与 ARV 二重 PCR。优化后的二重 PCR 反应体系为：2× PCR Mix 12．5μL，其中ChPV 与 ARV 的上、下游引物各1．0μL，混合模板2．0μL，ddH2 O 补足25μL；最佳的反应程序为：95°C5 min；95°C1 min，56．1°C1 min，72°C1 min，35个循环；最后72°C延伸10 min。结果显示，建立的二重 PCR能够同时扩增出204 bp ChPV 和405 bp ARV 片段；该方法对 ChPV 与 ARV 的检测敏感性分别达到58 fg和53 fg，但对鸡新城疫病毒、H9亚型禽流感病毒、马立克病病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、鸡传染性支气管炎病毒等病原体均无特异性扩增，对 ChPV 与 ARV 混合感染的临床阳性病料的检测结果与各病毒单项PCR 检测结果符合率为94％以上。建立的二重 PCR 可用于 ChPV 与 ARV 感染的快速鉴别诊断。

摘要： 根据已发表的结核分枝杆菌23s rRNA和牛分枝杆菌特殊基因序列，设计和合成了两对可扩增838bp和631bp目的片段的引物，建立了快速检测鉴别结核分枝杆菌和牛分枝杆菌的二重PCR方法。对牛分枝杆菌参考株和国内分离株进行扩增结果成功扩增出839bp和631bp的特异性基因片段；对人结核分枝杆菌只扩增出839bp基因片段而扩增不出631bp的特异性基因片段；对参试的基它牛的菌株DNA进行PcR扩增结果均为阴性。敏感性测定，该方法能检测到的敏感度可达到50pg的DNA含量。应用该方法对238份牛临床样品的DNA分别进行了二重PCR检测，结果有22份临床样品经PCR扩增检测为结核分枝杆菌阳性，其中含2份PCR扩增为牛分枝杆菌阳性，其它临床样品扩增结果全部为阴性。本方法可做为牛分枝杆菌的快速检测和流行病学调查的工具。

摘要： 根据已发表的结核分枝杆菌23s rRNA和牛分枝杆菌特殊基因序列，设计和合成了两对可扩增838bp和631bp目的片段的引物，建立了快速检测鉴别结核分枝杆菌和牛分枝杆菌的二重PCR方法。对牛分枝杆菌参考株和国内分离株进行扩增结果成功扩增出839bp和631bp的特异性基因片段；对人结核分枝杆菌只扩增出839bp基因片段而扩增不出631bp的特异性基因片段；对参试的基它牛的菌株DNA进行PcR扩增结果均为阴性。敏感性测定，该方法能检测到的敏感度可达到50pg的DNA含量。应用该方法对238份牛临床样品的DNA分别进行了二重PCR检测，结果有22份临床样品经PCR扩增检测为结核分枝杆菌阳性，其中含2份PCR扩增为牛分枝杆菌阳性，其它临床样品扩增结果全部为阴性。本方法可做为牛分枝杆菌的快速检测和流行病学调查的工具。

摘要： 根据已发表的结核分枝杆菌23s rRNA和牛分枝杆菌特殊基因序列，设计和合成了两对可扩增838bp和631bp目的片段的引物，建立了快速检测鉴别结核分枝杆菌和牛分枝杆菌的二重PCR方法。对牛分枝杆菌参考株和国内分离株进行扩增结果成功扩增出839bp和631bp的特异性基因片段；对人结核分枝杆菌只扩增出839bp基因片段而扩增不出631bp的特异性基因片段；对参试的基它牛的菌株DNA进行PcR扩增结果均为阴性。敏感性测定，该方法能检测到的敏感度可达到50pg的DNA含量。应用该方法对238份牛临床样品的DNA分别进行了二重PCR检测，结果有22份临床样品经PCR扩增检测为结核分枝杆菌阳性，其中含2份PCR扩增为牛分枝杆菌阳性，其它临床样品扩增结果全部为阴性。本方法可做为牛分枝杆菌的快速检测和流行病学调查的工具。

摘要： 根据已发表的结核分枝杆菌23s rRNA和牛分枝杆菌特殊基因序列，设计和合成了两对可扩增838bp和631bp目的片段的引物，建立了快速检测鉴别结核分枝杆菌和牛分枝杆菌的二重PCR方法。对牛分枝杆菌参考株和国内分离株进行扩增结果成功扩增出839bp和631bp的特异性基因片段；对人结核分枝杆菌只扩增出839bp基因片段而扩增不出631bp的特异性基因片段；对参试的基它牛的菌株DNA进行PcR扩增结果均为阴性。敏感性测定，该方法能检测到的敏感度可达到50pg的DNA含量。应用该方法对238份牛临床样品的DNA分别进行了二重PCR检测，结果有22份临床样品经PCR扩增检测为结核分枝杆菌阳性，其中含2份PCR扩增为牛分枝杆菌阳性，其它临床样品扩增结果全部为阴性。本方法可做为牛分枝杆菌的快速检测和流行病学调查的工具。

摘要： 本发明公开了一种鸭甲肝病毒1型和3型二重二温式RT‑PCR检测试剂盒，该试剂盒含有两对特异性引物。本发明具有操作简便、敏感性高、特异性强和重复性好等优点，应用本发明可建立鸭甲肝病毒1型和3型二重二温式RT‑PCR检测方法，实现同时检测和鉴别鸭甲肝病毒1型和3型两种病原体，既可以节约时间的成本，又可以减少污染。

摘要： 本发明公开了鸡细小病毒和鸡新城疫病毒二重PCR检测方法的建立。本发明提供了本发明提供了鉴定鸡细小病毒和鸡新城疫病毒的成套引物，其由如下引物1至引物4组成：所述引物1为序列表的序列1所示的单链DNA分子；所述引物2为序列表的序列2所示的单链DNA分子；所述引物3为序列表的序列3所示的单链DNA分子；所述引物4为序列表的序列4所示的单链DNA分子。本试验所建立的ChPV和NDV二重PCR方法可以用于临床ChPV和NDV的混合感染的快速检测，适于大批量检测，既可节约成本和节省时间，又能减少污染，具有很高的实用价值。

摘要： 本发明提供了一种阿胶及原料中马、驴、骡源性成分二重PCR检测试剂盒，属于动物源性成分分子检测技术领域。本发明试剂盒包括马和驴特异性引物、反应试剂、阳性对照以及空白对照。所述引物包括马特异性引物(Horse‑F、R)、驴特异性引物(引物对1：Donkey‑1‑F、R或引物对2：Donkey‑2‑F、R)。可以用于皮张及阿胶等马、驴等不同来源成分的鉴定。本发明检测方法稳定性好、特异性强、操作简单、结果判断直接，可为阿胶企业和食品药品监管部门提供有效、精准、可靠的驴皮及其阿胶制品的鉴定方法，也为阿胶企业原料采购及其阿胶制品真实性保驾护航。

摘要： 本发明属于生物检测技术领域，涉及一种同时检测MS‑H疫苗株和通用型的二重PCR引物组及试剂盒，该引物组包含两对引物，分别是MS‑H疫苗株上下游引物对和通用型上下游引物对；其中，MS‑H疫苗株上下游引物对为SEQ ID NO:1所示的疫苗株上游引物、SEQ ID NO:2所示的疫苗株下游引物，通用型上下游引物对为SEQ ID NO:3所示的通用型上游引物和SEQ ID NO:4所示的通用型下游引物。利用本发明提供的试剂盒检测鸡滑液囊支原体MS‑H疫苗株和通用型准确性高、特异性强、灵敏度高、易于操作、快速且结果可靠。

摘要： 本发明公开了一种鸭甲肝病毒1型和3型二重二温式RT-PCR检测试剂盒，该试剂盒含有两对特异性引物。本发明具有操作简便、敏感性高、特异性强和重复性好等优点，应用本发明可建立鸭甲肝病毒1型和3型二重二温式RT-PCR检测方法，实现同时检测和鉴别鸭甲肝病毒1型和3型两种病原体，既可以节约时间的成本，又可以减少污染。

摘要： 本发明涉及用于PRRSV和CSFV二重荧光定量PCR检测的引物探针组、试剂盒及检测方法，属于分子生物学技术领域。为进一步提高PRRSV和CSFV二重荧光定量PCR联检的准确性，本发明提供了用于PRRSV和CSFV二重荧光定量PCR检测的引物探针组，以PRRSV的ORF6基因和CSFV的5′UTR非编码区作为扩增靶区域设计的针对PRRSV的引物探针组和针对CSFV的引物探针组，保证了检测基因位点的保守性和稳定性，引物探针组序列结构不存在相互作用，扩增效率和结合率高，具有很高的检测敏感性。本发明提供的检测试剂盒同相似病原体无交叉反应，具有较高的特异性和准确性，能满足大批量快速鉴别检测的要求。

摘要： 本发明涉及一种用于快速直接二重PCR扩增的处理液、扩增体系及试剂盒，具体公开了用于直接PCR扩增的预处理液，所述的预处理液为含有0.25mol/LNaOH和0.5mmol/L Na

摘要： 本发明公开了一种基于二重荧光定量PCR鉴定毕赤酵母表达体系中目的基因拷贝数的方法，广泛适用于以PAOX1为启动子的目的基因拷贝数的鉴定。该方法相较于传统qPCR测定目的基因拷贝数的优点在于：由于探针的存在，测量准确度和重复性远高于传统染料法qPCR。相比于传统探针法qPCR，D‑qPCR会节约1倍的试剂成本，且精密度与重复性可与之相媲美。在同一PCR管反应体系下，同时对PAOX1启动子基因和内参基因进行扩增及荧光定量分析，将筛选通量提高一倍，避免了分开扩增带来的加样误差，同时节约了成本。本专利提供一种通用D‑qPCR体系，包括引物、探针、反应体系的成分以及测量方法，用于高效、快速、准确鉴定与筛选目的基因的拷贝数。

摘要： 本发明公开了用于家蚕核型多角体病毒、质型多角体病毒二重PCR的检测引物及其应用与试剂盒，属于家蚕养殖技术领域。本发明所述的检测引物包括SEQ ID NO.1～4所示的引物。本发明还公开了家蚕核型多角体病毒、质型多角体病毒二重PCR检测方法及检测试剂盒。本发明通过引物设计、条件优化以及特异性、敏感性、重复性试验，成功建立了BmNPV、BmCPV二重PCR的检测方法，该方法可用于两种主要家蚕病毒病的快速鉴别诊断及流行病学调查。

摘要： 本实用新型提供一种牛布鲁氏菌与牛结核分支杆菌二重荧光PCR快速检测试剂盒，所述试剂盒包括盒体以及设于盒体内的试剂放置架，所述盒体顶部设置有盒盖；所述盒体内纵向升降安装有升降板，且升降板板体上环向间隔设置有多跟振动弹簧；所述试剂放置架固定设置在所述振动弹簧上，且试剂放置架顶部等间距设置有若干支撑试剂管的放置位孔，试剂放置架底部固定设置有振动电机；所述盒体内位于升降板底部设有用于驱动升降板的升降驱动组件。本实用新型结构紧凑，不仅可便捷的实现试剂管的取用，而且实现对试剂管内药剂的震荡混匀，提高试剂盒的工作效率。