质粒DNA

摘要： 日前,颇尔筹划投资1.14亿美元,以提高全球产能,来满足因COVID-19不断增加的需求量。2月3日,瓦克收购位于美国的质粒DNA生产商Genopis公司。3月2日,药明康德宣布完成对英国基因治疗技术公司OXGENE的收购。近日,安进以近20亿美元囊获创新胃癌一线疗法。

摘要： 目的 通过微针经皮递送携带肝细胞生长因子(HGF)重组质粒pHGF,探究微针介导HGF基因表达治疗湿疹的作用.方法 制备筛选pHGF透明质酸可溶性微针贴并进行表观机械性能检测、皮肤插入染色试验及小动物活体成像.实验小鼠随机分为模型组、阳性对照组、微针贴组及皮下注射组,采用2,4-二硝基氯苯(DNCB)皮肤致敏建立湿疹模型,按皮肤症状评分和苏木素-伊红(HE)染色切片观察皮肤病理情况,评价载药微针贴的治疗效果.结果 透明质酸可溶性微针贴结构完整,机械强度较好,能较好地插入小鼠皮肤成功染色并能将质粒DNA有效递送到皮内表达.第28天后与模型组BALB/c小鼠相比,微针贴组和皮下注射组皮损积分较低(均P＜0.01),HE病理染色切片显示,皮肤炎性浸润较轻,皮下附件修复较好.结论 微针经皮递送pHGF基因表达能对湿疹模型小鼠起到较好的治疗作用.

摘要： 转基因成分检测是转基因生物安全应用和管理的重要技术支撑,转基因标准物质种类的不足可影响转基因生物检测方法的建立和标准化。选取玉米MON863中外源基因MON863与内标基因Adh1构建质粒标准物质,通过测序验证,以双重数字PCR技术对获得的质粒DNA进行均匀性及不同温度下(-20、4、25、37°C)短期(14 d)和-20°C长期(6个月)稳定性检验,联合8家实验室进行定值分析。结果显示,玉米MON863质粒DNA标准物质具备良好的均匀性,可以在-20°C稳定存放6个月;外源与内标基因的拷贝数比值为1.01,扩展不确定度为0.04;拷贝数为5.78×10^(10) copies/μL,扩展不确定度为0.29×10^(10) copies/μL。获得的标准物质适用于玉米MON863的方法学建立、定性定量检测和实验室质控等应用。

摘要： 作为基因传递的载体,质粒DNA已被广泛应用于DNA疫苗和基因治疗。质粒DNA存在不同的构型,其中超螺旋构型的质粒在细胞中的转染和表达效率最高。美国食品与药品监督管理局在2007年发布了质粒DNA疫苗的工艺指导原则,建议超螺旋构型的比例大于80%,因此建立高灵敏度和高分辨率的方法用于质粒DNA构型分离和分析具有重要意义。就近年来质粒DNA构型的分离和分析方法进行了综述,主要包括琼脂糖凝胶电泳法、液相色谱法和毛细管凝胶电泳法,并对未来质粒DNA构型分离和分析方法的发展提出了展望。

摘要： 针对转基因玉米MON863质粒DNA,研究建立一套双重数字PCR(ddPCR)定值方法.优化引物探针浓度,退火温度等条件,考察方法特异性、线性范围、精密度.结果表明,外源基因MON863在1.6～6743.3 copies和内源基因Adh在1.1～6770.0 copies的浓度范围均呈线性关系,r2为1;MON863基因和Adh基因的定量限分别为8.3 copies和7.9 copies;方法精密度小于5％.采用该方法对基体标准物质进行验证,误差小于10％.该方法每个反应体系都含有内源(VIC)和外源(FAM)基因,能实现内外源基因的同时检测,避免同一样品在不同反应体系造成的定值差异.结果显示该方法与单重数字PCR定值结果无显著差异,重复性优于单重数字PCR结果,方法准确可靠.

摘要： 目的 通过构建体外质粒DNA作为质控样品开展他克莫司代谢基因——细胞色素P4503A5(CYP3A5)基因检测室间质量评价计划(简称室间质评),评估参评实验室检测能力及存在的问题,提高临床实验室CYP3A5基因的检测质量.方法利用基因工程技术体外构建含CYP3A5*3(rs776746)位点上、下游序列的重组质粒,筛选CYP3A5*3 AA和GG基因型分别作为野生型和突变型样品,两者等比例混合后作为杂合突变型样品,并制备质控样品盘开展室间质量评价.依据回报结果计算各实验室成绩,汇总不同样品的总体符合率,并分析不同检测方法的符合率和检测错误类型.结果体外构建的重组质粒经Sanger测序验证分别含CYP3A5*3位点野生型和突变型序列.2017年两次室间质评中成绩满分的实验室分别为93.33％(14/15)和100％(17/17).两次室间质评中,样品检测的总体符合率分别为96％(72/75)和100％(85/85).荧光分子杂交法检测的样品符合率均为100％;Sanger测序法检测样品符合率为90％(27/30)和100％(40/40).结论制备的质控样品能够有效监测试剂检测性能,具有良好的适用性.各实验室在CYP3A5*3基因位点检测总体准确率较高,但个别实验室检测能力有待提高.室间质评计划能帮助实验室发现检测中存在的问题,提高检测质量.

摘要： 为保证H7N9禽流感病毒核酸检测方法的可比性、有效性和可靠性,研制了一种质粒DNA标准物质,包含H7N9禽流感病毒实时荧光RT-PCR检测方法的靶标基因(H7、N9基因序列)和内参基因(M基因、RnaseP基因序列),具有良好的序列准确度和量值溯源性.采用紫外分光光度法(UV)和高分辨电感耦合等离子对该标准物质的均匀性、稳定性进行了评估,并对定值不确定度进行了评定.结果显示,质粒DNA标准物质量值可靠,均匀性和稳定性良好,可以在-20°C下保存1 a以上,且无生物危害.对质粒DNA标准物质在实时荧光RT-PCR检测中的应用性考察结果证明,其适用于多种实时荧光RT-PCR检测方法,可保证H7N9禽流感病毒实时荧光RT-PCR检测结果的可比性,为其提供生物计量技术支持.

摘要： 为揭示大气颗粒物危害健康的作用机制,采用聚碳酸脂滤膜采集PM2.5样品,测定47种微量元素的含量.利用质粒DNA凝胶电泳法测定样品的TD50值,建立多元素与TD50值相耦合的数学模型,分析PM2.5颗粒物中金属元素损伤DNA的作用模式.结果表明,47种元素中Cu、Zn、Mo、In、Sb、W、Tl、Pb、Bi、Ti 10种元素的富集因子大于10,主要来源于人为源.同一地点PM2.5的来源随季节变化,TD50值变化范围为109.8～1 345.0 mg/L.Eu、W、Er、Y、Ho、Zr、Li、Cd、Hf九种元素的质量摩尔浓度与样品的TD50值呈现多因子耦合模式.Eu、Er、Zr、Li四种元素的质量摩尔浓度与TD50值之间呈正相关关系,W、Y、Ho、Cd、Hf五种元素的质量摩尔浓度与TD50值之间呈负相关关系,表现为正相关元素联合抑制负相关元素对DNA的联合损伤.该结果为大气颗粒物的细胞毒性研究提供了理论依据.

摘要： 本文旨在定性研究在声孔效应产生的条件下，质粒DNA进入细胞的方式。实验中通过共聚焦三维扫描质粒DNA在细胞内的空间分布，并将靶向微泡作用位点和质粒DNA的空间位置关系相关联，以获取质粒DNA进入细胞内的有效方式。内吞抑制剂与未加抑制剂组的实验比对进一步确认内吞作用是否为有效的转染途径。

摘要： 本文旨在定性研究在声孔效应产生的条件下，质粒DNA进入细胞的方式。实验中通过共聚焦三维扫描质粒DNA在细胞内的空间分布，并将靶向微泡作用位点和质粒DNA的空间位置关系相关联，以获取质粒DNA进入细胞内的有效方式。内吞抑制剂与未加抑制剂组的实验比对进一步确认内吞作用是否为有效的转染途径。

摘要： 本文旨在定性研究在声孔效应产生的条件下，质粒DNA进入细胞的方式。实验中通过共聚焦三维扫描质粒DNA在细胞内的空间分布，并将靶向微泡作用位点和质粒DNA的空间位置关系相关联，以获取质粒DNA进入细胞内的有效方式。内吞抑制剂与未加抑制剂组的实验比对进一步确认内吞作用是否为有效的转染途径。

摘要： 本文旨在定性研究在声孔效应产生的条件下，质粒DNA进入细胞的方式。实验中通过共聚焦三维扫描质粒DNA在细胞内的空间分布，并将靶向微泡作用位点和质粒DNA的空间位置关系相关联，以获取质粒DNA进入细胞内的有效方式。内吞抑制剂与未加抑制剂组的实验比对进一步确认内吞作用是否为有效的转染途径。

摘要： 本研究以本课题组构建的携带禽传染性支气管炎病毒S1、M、N基因真核表达质粒(pVA×1-S1、pVA×1-M、pVA×1-N、VR1020-S1、VR1020-M、VR 1020-N)的大肠杆菌工程菌为研究对象，对其发酵工艺进行了研究。采用单因子分析和正交设计，摇瓶发酵对各重组大肠杆菌基因工程菌的培养基条件进行了研究，包括碳源、氮源和无机盐离子的筛选，并在5L发酵罐中扩大培养优化其接种量、培养温度、初始pH及溶氧等培养条件。对发酵液用热激法和碱裂解法两种不同的提取方法进行粗提比较，对碱裂解法进行优化，对裂解时间和裂解反应液的比例进行研究，再用聚乙二醇和硅藻土两种方法进行纯化比较。本研究确定优化了培养基的成份，为12g/L胰蛋白胨，4g/L酵母提取物，10g/L葡萄糖，6ml/L甘油，3g/L NaCl，8g/L Na2HPO4，3g/LKH2PO4。优化了上罐发酵培养条件，为接种量5％、温度42°C、pH7.2、D050％。建立了以碱裂解法粗提，硅藻土法纯化的质粒DNA提纯工艺。该工艺可去除大部分RNA、基因组DNA和蛋白质等杂质，提取的质粒DNA纯度可达到1.88，超螺旋比例达到98.4％，符合世界卫生组织关于质粒产品的质量要求。与传统纯化方法比较，生产成本降低了20-40％。本研究降低了基因工程菌发酵和质粒提取的生产成本，为DNA疫苗的大规模生产提供了理论和实验依据。

摘要： 本研究以本课题组构建的携带禽传染性支气管炎病毒S1、M、N基因真核表达质粒(pVA×1-S1、pVA×1-M、pVA×1-N、VR1020-S1、VR1020-M、VR 1020-N)的大肠杆菌工程菌为研究对象，对其发酵工艺进行了研究。采用单因子分析和正交设计，摇瓶发酵对各重组大肠杆菌基因工程菌的培养基条件进行了研究，包括碳源、氮源和无机盐离子的筛选，并在5L发酵罐中扩大培养优化其接种量、培养温度、初始pH及溶氧等培养条件。对发酵液用热激法和碱裂解法两种不同的提取方法进行粗提比较，对碱裂解法进行优化，对裂解时间和裂解反应液的比例进行研究，再用聚乙二醇和硅藻土两种方法进行纯化比较。本研究确定优化了培养基的成份，为12g/L胰蛋白胨，4g/L酵母提取物，10g/L葡萄糖，6ml/L甘油，3g/L NaCl，8g/L Na2HPO4，3g/LKH2PO4。优化了上罐发酵培养条件，为接种量5％、温度42°C、pH7.2、D050％。建立了以碱裂解法粗提，硅藻土法纯化的质粒DNA提纯工艺。该工艺可去除大部分RNA、基因组DNA和蛋白质等杂质，提取的质粒DNA纯度可达到1.88，超螺旋比例达到98.4％，符合世界卫生组织关于质粒产品的质量要求。与传统纯化方法比较，生产成本降低了20-40％。本研究降低了基因工程菌发酵和质粒提取的生产成本，为DNA疫苗的大规模生产提供了理论和实验依据。

摘要： 本研究以本课题组构建的携带禽传染性支气管炎病毒S1、M、N基因真核表达质粒(pVA×1-S1、pVA×1-M、pVA×1-N、VR1020-S1、VR1020-M、VR 1020-N)的大肠杆菌工程菌为研究对象，对其发酵工艺进行了研究。采用单因子分析和正交设计，摇瓶发酵对各重组大肠杆菌基因工程菌的培养基条件进行了研究，包括碳源、氮源和无机盐离子的筛选，并在5L发酵罐中扩大培养优化其接种量、培养温度、初始pH及溶氧等培养条件。对发酵液用热激法和碱裂解法两种不同的提取方法进行粗提比较，对碱裂解法进行优化，对裂解时间和裂解反应液的比例进行研究，再用聚乙二醇和硅藻土两种方法进行纯化比较。本研究确定优化了培养基的成份，为12g/L胰蛋白胨，4g/L酵母提取物，10g/L葡萄糖，6ml/L甘油，3g/L NaCl，8g/L Na2HPO4，3g/LKH2PO4。优化了上罐发酵培养条件，为接种量5％、温度42°C、pH7.2、D050％。建立了以碱裂解法粗提，硅藻土法纯化的质粒DNA提纯工艺。该工艺可去除大部分RNA、基因组DNA和蛋白质等杂质，提取的质粒DNA纯度可达到1.88，超螺旋比例达到98.4％，符合世界卫生组织关于质粒产品的质量要求。与传统纯化方法比较，生产成本降低了20-40％。本研究降低了基因工程菌发酵和质粒提取的生产成本，为DNA疫苗的大规模生产提供了理论和实验依据。

摘要： 本研究以本课题组构建的携带禽传染性支气管炎病毒S1、M、N基因真核表达质粒(pVA×1-S1、pVA×1-M、pVA×1-N、VR1020-S1、VR1020-M、VR 1020-N)的大肠杆菌工程菌为研究对象，对其发酵工艺进行了研究。采用单因子分析和正交设计，摇瓶发酵对各重组大肠杆菌基因工程菌的培养基条件进行了研究，包括碳源、氮源和无机盐离子的筛选，并在5L发酵罐中扩大培养优化其接种量、培养温度、初始pH及溶氧等培养条件。对发酵液用热激法和碱裂解法两种不同的提取方法进行粗提比较，对碱裂解法进行优化，对裂解时间和裂解反应液的比例进行研究，再用聚乙二醇和硅藻土两种方法进行纯化比较。本研究确定优化了培养基的成份，为12g/L胰蛋白胨，4g/L酵母提取物，10g/L葡萄糖，6ml/L甘油，3g/L NaCl，8g/L Na2HPO4，3g/LKH2PO4。优化了上罐发酵培养条件，为接种量5％、温度42°C、pH7.2、D050％。建立了以碱裂解法粗提，硅藻土法纯化的质粒DNA提纯工艺。该工艺可去除大部分RNA、基因组DNA和蛋白质等杂质，提取的质粒DNA纯度可达到1.88，超螺旋比例达到98.4％，符合世界卫生组织关于质粒产品的质量要求。与传统纯化方法比较，生产成本降低了20-40％。本研究降低了基因工程菌发酵和质粒提取的生产成本，为DNA疫苗的大规模生产提供了理论和实验依据。

摘要： 本研究以本课题组构建的携带禽传染性支气管炎病毒S1、M、N基因真核表达质粒(pVA×1-S1、pVA×1-M、pVA×1-N、VR1020-S1、VR1020-M、VR 1020-N)的大肠杆菌工程菌为研究对象，对其发酵工艺进行了研究。采用单因子分析和正交设计，摇瓶发酵对各重组大肠杆菌基因工程菌的培养基条件进行了研究，包括碳源、氮源和无机盐离子的筛选，并在5L发酵罐中扩大培养优化其接种量、培养温度、初始pH及溶氧等培养条件。对发酵液用热激法和碱裂解法两种不同的提取方法进行粗提比较，对碱裂解法进行优化，对裂解时间和裂解反应液的比例进行研究，再用聚乙二醇和硅藻土两种方法进行纯化比较。本研究确定优化了培养基的成份，为12g/L胰蛋白胨，4g/L酵母提取物，10g/L葡萄糖，6ml/L甘油，3g/L NaCl，8g/L Na2HPO4，3g/LKH2PO4。优化了上罐发酵培养条件，为接种量5％、温度42°C、pH7.2、D050％。建立了以碱裂解法粗提，硅藻土法纯化的质粒DNA提纯工艺。该工艺可去除大部分RNA、基因组DNA和蛋白质等杂质，提取的质粒DNA纯度可达到1.88，超螺旋比例达到98.4％，符合世界卫生组织关于质粒产品的质量要求。与传统纯化方法比较，生产成本降低了20-40％。本研究降低了基因工程菌发酵和质粒提取的生产成本，为DNA疫苗的大规模生产提供了理论和实验依据。

摘要： 限制性内切酶介导整合(REMI)技术是一种在限制性内切酶存在的条件下,将线性化的质粒DNA随机插入到真菌基因组DNA中,从而产生插人突变的技术.本文综述介绍了限制性内切酶介导的整合技术的一些基本情况,包括REMI的步骤、技术原理、应用范围、应用概况、技术优点和存在问题等。

摘要： 本发明涉及一种提取质粒DNA的菌体裂解液、试剂盒及提取质粒DNA的方法，属于生物技术领域。本发明提取质粒DNA的菌体裂解液由裂解缓冲液、溶菌酶、RNase A组成，裂解缓冲液的组成为：每100mL裂解缓冲液中含有1.5～10g蔗糖、0.7～2.2g乙二胺四乙酸二钠、0.3～0.9g三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐、2.7～5.4g NH4Cl、0.1～2.0mL 0.5％的Triton X‑100、0.2～0.6g CaCl2、0.5～8g盐酸胍、0.5～3g异硫氰酸胍，其余量为水。本发明提取质粒DNA的试剂盒，包括上述菌体裂解液、漂洗液和洗脱液。该试剂盒成本低、提取质粒纯度高、适用性好。

摘要： 本发明公开了一种质粒DNA的产业化纯化方法及质粒DNA，所述纯化方法包括以下步骤：在质粒DNA超滤浓缩液中加入辛酸钠，混匀后，常温放置一段时间，接着低温静置一定时间，然后澄清处理；然后依次进行离子交换层析、疏水层析、超滤除盐浓缩和过滤除菌，完成纯化。本发明在低温条件下，将辛酸钠应用于质粒DNA产品的纯化，不仅操作简便易放大，减少了操作步骤，同时提高了纯化质粒的总回收率，并符合药用标准；而且大大减少了硫酸铵的使用，降低了对操作人员和环境的影响。本发明纯化方法纯化效果好而且纯化过程大大减少了硫酸铵试剂的使用，重复性强，操作简单，可满足工业产业化纯化生产要求。

摘要： 本发明提供一种DNA Marker的制备方法及其质粒和质粒的制备方法，其特征在于，包括：预定长度的多条DNA Marker片段，各片段之间具有相同的酶切位点。本发明通过在载体构建过程中合理搭配不同大小的DNA片段及其拷贝数，使得质粒DNA通过完全酶切后，一次性得到DNA Marker中各条带，且各条带之间的亮度基本一致，从而实现DNA Marker在凝胶上的均一性。

摘要： 一种基因共表达重组质粒及由该质粒制成的DNA疫苗，其特征在于依次包括鸡防御素-1基因片段的PCR扩增过程、重组质粒pcDNA3.1(+)-Gal-1的构建过程、鸡法氏囊病病毒VP2基因的PCR扩增过程、鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因与鸡防御素-1基因共表达重组质粒pcDNA3.1(+)-Gal-1/VP2的构建过程、鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因与鸡防御素-1基因共表达重组质粒pcDNA3.1(+)-Gal-1/VP2培养过程提取过程。本发明与已有技术相比，具有防御素所特有的免疫增强作用的、适合鸡使用的、可用于预防鸡传染性法氏囊病的优点。

摘要： 本发明提供了一种磁珠法提取质粒DNA的试剂盒，包括质粒提取试剂和羟基磁珠，质粒提取试剂包括溶液I、溶液II、溶液III、磁珠结合液、漂洗液和洗脱液。溶液I、溶液II、溶液III的混合比例为1：1：1.4。还提供了利用上述磁珠法提取质粒DNA的试剂盒来提取高纯度质粒DNA的方法。本发明所述的磁珠法提取质粒DNA的试剂盒及提取质粒DNA的方法，缩短了质粒提取时间，提取的质粒能够满足后续PCR、酶切、转化和转染等实验的大量需求，减少了时间和经济成本。

摘要： 本发明公开了一种基于巴氏灭菌的质粒DNA灭菌处理方法，其特征在于，包含以下步骤：步骤1：制备质粒DNA，将质粒DNA转移至离心管；步骤2：将上述离心管放入预热好的恒温金属浴中进行孵育；所述预热温度为72°C；所述孵育时间为30min以上；步骤3：孵育完成后取出离心管，快速降温冷却；步骤4：冷却完成后取出离心管，进行离心处理；步骤5：离心完成后取出离心管，离心管内为灭菌质粒DNA；能够大幅度降低蛋白表达的质粒转染过程导致的污染概率，一次性的成功转染缩短了获得目的蛋白的周期，节约了时间成本，避免了昂贵的试剂成本和人力成本的浪费。

摘要： 本发明公开了一种质粒DNA的产业化纯化方法及质粒DNA，所述纯化方法包括以下步骤：在质粒DNA超滤浓缩液中加入辛酸钠，混匀后，常温放置一段时间，接着低温静置一定时间，然后澄清处理；然后依次进行离子交换层析、疏水层析、超滤除盐浓缩和过滤除菌，完成纯化。本发明在低温条件下，将辛酸钠应用于质粒DNA产品的纯化，不仅操作简便易放大，减少了操作步骤，同时提高了纯化质粒的总回收率，并符合药用标准；而且大大减少了硫酸铵的使用，降低了对操作人员和环境的影响。本发明纯化方法纯化效果好而且纯化过程大大减少了硫酸铵试剂的使用，重复性强，操作简单，可满足工业产业化纯化生产要求。

摘要： 本发明涉及一种提取质粒DNA的试剂盒，包括磁性分离介质和至少一种质粒提取试剂，其中所述磁性分离介质为粒径为50～1000nm的磁性纳米微球。本发明还提供了一种磁珠法提取质粒DNA的方法。本发明的方法利用磁性分离介质的超顺磁性实现磁性分离，省略离心步骤，这种方法快速简便,价格低廉，而且易于实现自动化。

摘要： 本发明涉及一种提取质粒DNA的菌体裂解液、试剂盒及提取质粒DNA的方法，属于生物技术领域。本发明提取质粒DNA的菌体裂解液由裂解缓冲液、溶菌酶、RNase A组成，裂解缓冲液的组成为：每100mL裂解缓冲液中含有1.5～10g蔗糖、0.7～2.2g乙二胺四乙酸二钠、0.3～0.9g三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐、2.7～5.4g NH

摘要： 本发明提供一种DNA？Marker的制备方法及其质粒和质粒的制备方法，其特征在于，包括：预定长度的多条DNA？Marker片段，各片段之间具有相同的酶切位点。本发明通过在载体构建过程中合理搭配不同大小的DNA片段及其拷贝数，使得质粒DNA通过完全酶切后，一次性得到DNA？Marker中各条带，且各条带之间的亮度基本一致，从而实现DNA？Marker在凝胶上的均一性。