表达载体构建

摘要： 为研究腺苷酸基琥珀酸合成酶(Adenylosuccinate synthase,简称Adss)在原生动物中的作用,对浮萍棘尾虫(Stylonychia lemnae)腺苷酸基琥珀酸合成酶Adss基因进行PCR克隆,获得全长为1396 bp左右的序列,其编码458个氨基酸,保守结构域含有一个P-loop NTPase结构域,蛋白结构预测Adss蛋白是由α-螺旋、β-折叠和无规卷曲组成的复杂结构。多重序列比对和系统进化分析显示浮萍棘尾虫Adss蛋白与第四双小核草履虫、多子小瓜虫和嗜热四膜虫等纤毛虫同源性较高。通过克隆浮萍棘尾虫Adss基因的启动子序列,并采用增强型绿色荧光蛋白EGFP作为报告基因,构建了启动子序列调控的表达载体pEGFP-N1-Adss,通过转染细胞确定浮萍棘尾虫Adss蛋白定位于细胞质中。文章报道了原生动物纤毛虫Adss基因,证实浮萍棘尾虫Adss蛋白属于典型的真核生物Adss,为进一步揭示Adss在单细胞真核生物中的作用机制提供了新的参考。

摘要： 为构建牛环形泰勒虫AMA1(TaAMA1)截短基因原核、真核表达载体,对其编码的蛋白进行生物信息学分析,以牛环形泰勒虫阳性DNA为模板,在牛环形泰勒虫AMA1基因的开放性阅读框内设计特异性引物,采用PCR扩增AMA1基因,构建其原核表达质粒pET28a-AMA1及真核表达质粒pEGFP-AMA1。通过生物信息学在线软件分析TaAMA1基因的系统进化树及该蛋白的理化性质、磷酸化位点、亚细胞定位、抗原表位及二级结构,构建该重组蛋白系统发育进化树。结果显示,TaAMA1基因PCR扩增产物大小为828 bp,与预期片段一致,构建的重组质粒经双酶切鉴定表明目的基因插入正确,测序结果与GenBank已收录的牛环形泰勒虫AMA1基因序列(KX231677.1)同源性为99.72%,同源性及系统进化树分析发现与小泰勒虫氨基酸序列同源性最大为69.9%,生物信息学分析发现TaAMA1基因编码蛋白含276个氨基酸,分子式为C_(1331)H_(2134)N_(398)O_(413)S_(4),分子质量为30.448 ku,理论等电点为9.94,有38个磷酸化修饰位点,无跨膜区及信号肽,亚细胞定位预测位于细胞核的比例为87%;B细胞抗原表位分析发现该蛋白含有9个潜在抗原表位;TaAMA1蛋白的二级结构中α-螺旋、β-转角、延伸链和无规则卷曲和延伸链分别占23.91%、7.61%、49.64%和18.84%。成功构建重组原核表达质粒pET28a-AMA1及真核表达质粒pEGFP-AMA1并进行生物信息学分析,为牛环形泰勒虫AMA1蛋白生物学功能及入侵机制研究奠定了基础。

摘要： [目的]克隆龙眼MYB-related基因家族中MYB14基因,并对其进行生物信息学分析和基因表达载体的构建,为进一步研究该基因的生物学功能提供基础数据.[方法]通过转录组测序及生物信息学分析得到龙眼MYB14基因全长序列,进一步设计特异引物对其开放阅读框(ORF)全长序列进行克隆和生物信息学分析,同时构建超表达载体.[结果]MYB14基因属于MYB-related家族的TBP-like亚家族,ORF长度831 bp,编码276个氨基酸,有一个MYB结合位点.该蛋白属于非跨膜亲水蛋白,亚细胞定位预测定位于细胞质,存在57个氨基酸磷酸化位点.其二级结构主要由无规则卷曲以及 α-螺旋构成,二级结构与三级结构预测结果高度一致,同源基因进化树分析表明该基因与大麻亲缘关系最近,同时成功构建了植物超表达载体pBI121-MYB14.[结论]本研究克隆得到了龙眼MYB14基因,成功构建表达载体pBI121-MYB14,为该基因功能的研究奠定了坚实的基础.

摘要： 无机焦磷酸酶(inorganic pyrophosphatase,PPase)催化焦磷酸(PPi)水解为2个无机正磷酸(Pi),是蔗糖合成途径中的调控关键节点之一.本研究根据已经报道的PPase基因的序列设计兼并引物,采用3′RACE和5′RACE方法,从贵妃芒果的果实中克隆得到了一个芒果PPase基因,将其命名为MiPPase,其全长cDNA序列为1014bp,开放阅读框为837bp,编码278个氨基酸,分子量为30.85 ku,等电点为4.68.通过系统发育分析发现该基因编码的蛋白与红花烟草具有较近的亲缘关系.为深入探究MiPPase基因在蔗糖代谢过程中的作用,本研究成功构建出pGreenII 62-SK-MiPPase基因过量表达载体,为后续研究MiPPase基因在芒果果实蔗糖合成的作用机理提供理论依据.

摘要： 为了了解核桃FLOWERING LOCUS T(JrFT)基因在核桃雌雄异熟开花机制中的作用,以核桃雌先型品种'极早丰'与雄先型品种'新早丰'在3个时期(2月6日、3月21日及4月7日)的雌、雄花芽为试验材料,结合荧光定量PCR(qRT-PCR)、RT-PCR扩增、生物信息技术,分析了核桃JrFT基因的结构与表达,预测了JrFT基因的功能.结果表明:核桃JrFT基因在'极早丰'与'新早丰'3个时期的雌、雄花芽中均有表达;在不同时期同一花芽JrFT基因的表达量有所差异;在同一时期,JrFT基因在雌花中的表达量明显高于雄花,在'新早丰'雄花中的表达量高于在'极早丰'雄花中的表达量.克隆获得了JrFT基因的CDS序列,其长度为525 bp,编码174个氨基酸,含有高度保守的PEBP蛋白结构域.在NCBI数据库进行Blast比对显示:核桃JrFT基因与其他木本植物FT同源基因的相似性较高,可达到80％以上;JrFT蛋白与其他植物FT蛋白的相似性也很高.系统进化分析也同样说明JrFT基因属于PEBP家族基因.因此推测JrFT基因可能在核桃开花进程中具有一定的促进作用.

摘要： 探讨辽宁绒山羊皮肤毛囊不同发育时期mir-1298-5p的调控作用及其与靶基因的潜在关系,为mir-1298-5p与其靶基因对皮肤毛囊发育作用提供理论依据。以辽宁绒山羊皮肤毛囊组织为材料,通过mi RNA的分离、表达、靶基因预测筛选及靶位点3'UTR表达载体构建,采用RT-PCR进行表达检测,在线靶基因预测软件预测mir-1298-5p的靶基因,并对其靶基因TGF-βR1的靶位点进行克隆测序、缺失突变。结果表明:靶基因预测发现TGF-βR1的3'UTR存在mir-1298-5p种子区结合位点,且mir-1298-5p及其靶基因TGF-βR1均在皮肤毛囊不同发育时期呈现差异性表达。mir-1298-5p对皮肤毛囊周期性发育可能起到一定的调控作用,并成功构建了TGF-βR1 3'UTR表达载体,为后期过表达转染体系的建立和功能基因的验证奠定了基础。

摘要： 结合茶条槭转录组数据库，利用RT-PCR的方法克隆得到茶条槭SDH基因，命名为AgSDH，并对该基因及其蛋白进行了生物信息学分析。结果显示，AgSDH基因的ORF全长为1563 bp，共编码520个氨基酸，推测蛋白相对分子量为57.219 kDa，理论等电点为5.61，无信号肽，预测亚细胞定位于细胞质中。生物信息学分析表明AgSDH蛋白为亲水性蛋白，没有跨膜结构。蛋白质二级结构α-螺旋占35.38%，延伸链占18.65%，无规则卷曲占45.96%；三级结构预测表明AgSDH蛋白以单体形式存在。与目前已知的多种植物的SDH蛋白具有相似的结构功能域。系统进化分析表明，AgSDH蛋白与脐橙SDH蛋白亲缘关系最为接近。该研究结果为深入了解该基因的功能和茶条槭次生代谢产物合成的调控机理提供了基础数据。%AAcer ginnala Maxim SDH gene was cloned by RT-PCR from the transcriptome database of Acer palmatum. The gene namedAgSDH and the bioinformatics analysis of the gene and its protein was carried out. The results showed that the ORF ofAgSDH gene was 1 563 bp, encoding 520 amino acids. The relative molecular mass of theAgSDH gene was 57.219 kDa, the theoretical isoelectric point was 5.61, and no signal peptide was detected. The subcellular localization was predicted in cytoplasm. Bioinformatic analysis showed that the AgSDH protein was a hydrophilic protein with no transmembrane structure. The secondary structure analysis showed that AgSDH comprised 35.38% of alpha-helix, 18.65 extended strains and 45.96% random coil. The tertiary structure prediction indicated that the AgSDH protein existed as monomer. And has similar structural domain to the SDH proteins of many known plant species. Phelogenetic analysis showed that the closest relative of AgSDH was that ofCitrus clementinaamong known SDHs. The results provide the basic data for understanding the function of this gene and regulating mechanism of secondary metabolites synthesis.

摘要： 目的：研究重组人活性蛋白C的基因克隆、表达载体构建、以及在哺乳动物细胞中的表达.方法：用RT—PCR法从人胎肝中克隆出人蛋白C轻重链基因，用PCR突变法获得人活性蛋白C的全基因，将所得全基因连接入哺乳动物细胞表达载体，并转染293细胞研究其表达和活性.结果：成功得到重组人活性蛋白C基因，并成功构建哺乳动物细胞表达载体和转染293细胞荻高效表达以及相关活性数据.结论：通过以上方法可以获得重组人活性蛋白C基因，并实现了在哺乳动物细胞中的高效表达.

摘要： 胰岛素样生长因子I (IGF-I)又叫生长介素C(Somotemed in C)，是影响猪出生后生长的主要生长因子。主要促进骨骼肌的生长，并且维持其他多种代谢功能，同时也是生长激素(GH)启动生长活性的主要介导者。在猪的发育过程中可能有促进生长并抑制脂肪沉积的作用。本实验旨在构建pcDNATM3.1(+)-hIGFI重组质粒，为后续实验奠定了基础。

摘要： 纤维素合成酶CesA 是植物纤维素合成途径的一个关键酶。以毛竹笋为材料，成功克隆了全长毛竹纤维素合成酶基因PeCesA，序列长度为3246bp,编码1081个氨基酸,该蛋白序列与水稻CesA的同源率达到96%，蛋白主要定位于细胞膜上，由8个序列保守的跨膜结构域组成，同时PeCesA 蛋白具有植物CesA的两个典型结构：Zn 指结构和“QVLRW”保守区。因此，可以证明所克隆的基因为毛竹PeCesA 基因，并将此基因构建到表达载体pBI121 中，经酶切和PCR 鉴定确认载体构建正确，这就为下一步PeCesA 转基因功能研究打下了基础。

摘要： 本研究主要目的是构建ScYLV-CP基因的原核表达载体，表达SCYLV-CP蛋白。采用PCR扩增出CP基因的蛋白编码序列，克隆到中间载体中，再经双酶切、亚克隆到表达载体中，构建该基因的表达载体pET-29a-CP，在大肠杆菌中用IPTG诱导表达，SDS-PAGE电泳。酶切鉴定表明表达载体内插入片段正确，在大肠杆菌中诱导后，出现一条分子量约为22kDa蛋白带，与CP基因开放阅读框架的理论推算值21.719 kDa相符。研究表明甘蔗黄叶病毒外壳蛋白能在原核细胞中高效表达，为建立甘蔗黄叶病毒血清学快速检测技术奠定基础。

摘要： 本研究主要目的是构建ScYLV-CP基因的原核表达载体，表达SCYLV-CP蛋白。采用PCR扩增出CP基因的蛋白编码序列，克隆到中间载体中，再经双酶切、亚克隆到表达载体中，构建该基因的表达载体pET-29a-CP，在大肠杆菌中用IPTG诱导表达，SDS-PAGE电泳。酶切鉴定表明表达载体内插入片段正确，在大肠杆菌中诱导后，出现一条分子量约为22kDa蛋白带，与CP基因开放阅读框架的理论推算值21.719 kDa相符。研究表明甘蔗黄叶病毒外壳蛋白能在原核细胞中高效表达，为建立甘蔗黄叶病毒血清学快速检测技术奠定基础。

摘要： 本研究主要目的是构建ScYLV-CP基因的原核表达载体，表达SCYLV-CP蛋白。采用PCR扩增出CP基因的蛋白编码序列，克隆到中间载体中，再经双酶切、亚克隆到表达载体中，构建该基因的表达载体pET-29a-CP，在大肠杆菌中用IPTG诱导表达，SDS-PAGE电泳。酶切鉴定表明表达载体内插入片段正确，在大肠杆菌中诱导后，出现一条分子量约为22kDa蛋白带，与CP基因开放阅读框架的理论推算值21.719 kDa相符。研究表明甘蔗黄叶病毒外壳蛋白能在原核细胞中高效表达，为建立甘蔗黄叶病毒血清学快速检测技术奠定基础。

摘要： 本研究主要目的是构建ScYLV-CP基因的原核表达载体，表达SCYLV-CP蛋白。采用PCR扩增出CP基因的蛋白编码序列，克隆到中间载体中，再经双酶切、亚克隆到表达载体中，构建该基因的表达载体pET-29a-CP，在大肠杆菌中用IPTG诱导表达，SDS-PAGE电泳。酶切鉴定表明表达载体内插入片段正确，在大肠杆菌中诱导后，出现一条分子量约为22kDa蛋白带，与CP基因开放阅读框架的理论推算值21.719 kDa相符。研究表明甘蔗黄叶病毒外壳蛋白能在原核细胞中高效表达，为建立甘蔗黄叶病毒血清学快速检测技术奠定基础。

摘要： 目的： 构建pET原核表达系统中结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶(Early secretory antigenic target,EsAT-6)蛋白的重组表达质粒,并初步表达EsAT-6蛋白。方法： 用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组扩增出ESAT-6基因片段,两端设计特异酶切位点,插入pET-32a(+)载体中,构建融合表达载体,经鉴定正确后,在大肠杆菌BL21菌体中表达。 结果： 所获得结核分枝杆菌EsAT-6蛋白基因序列与GenBank公布的序列完全一致;表达蛋白经SDS-PAGE分析,相对分子量与文献报道一致。

摘要： 目的： 构建pET原核表达系统中结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶(Early secretory antigenic target,EsAT-6)蛋白的重组表达质粒,并初步表达EsAT-6蛋白。方法： 用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组扩增出ESAT-6基因片段,两端设计特异酶切位点,插入pET-32a(+)载体中,构建融合表达载体,经鉴定正确后,在大肠杆菌BL21菌体中表达。 结果： 所获得结核分枝杆菌EsAT-6蛋白基因序列与GenBank公布的序列完全一致;表达蛋白经SDS-PAGE分析,相对分子量与文献报道一致。

摘要： 目的： 构建pET原核表达系统中结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶(Early secretory antigenic target,EsAT-6)蛋白的重组表达质粒,并初步表达EsAT-6蛋白。方法： 用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组扩增出ESAT-6基因片段,两端设计特异酶切位点,插入pET-32a(+)载体中,构建融合表达载体,经鉴定正确后,在大肠杆菌BL21菌体中表达。 结果： 所获得结核分枝杆菌EsAT-6蛋白基因序列与GenBank公布的序列完全一致;表达蛋白经SDS-PAGE分析,相对分子量与文献报道一致。

摘要： 本发明公开了一种通用型高效真核表达载体p3I-GFPN及采用该载体构建的抗乳腺炎的转基因载体，本发明构建的抗乳腺炎转基因载体pCMV/CSN2-hLY-hIFA，在乳腺细胞中能高水平表达绿色荧光蛋白，在泌乳期的乳腺细胞中，由于CSN2的启动子发挥了启动作用，使转pCMV/CSN2-hLY-hIFA的乳腺细胞分泌大量的人溶菌酶和人干扰素A，在通过乳汁分离获得目的蛋白的同时又能较好的防治家畜乳腺炎。

摘要： 本公开提供了一种裂殖壶菌的表达载体、表达载体的构建方法及应用，属于基因工程领域。所述表达载体包括：pSc‑18S rDNA载体、裂殖壶菌的启动子和终止子的组合、抗性‑荧光双筛选标记的基因序列；所述启动子和终止子的组合包括以下组合中的至少一种：启动子PT和终止子TT的组合、启动子PA1和终止子TA的组合、启动子PA2和终止子TA的组合以及启动子PE2和终止子TE的组合。本公开通过一种高效的裂殖壶菌基因组编辑及转化子筛选技术，通过将抗性‑荧光双筛选标记以融合蛋白表达的形式通过基因枪高效的整合至裂殖壶菌染色体，基于表达的荧光强弱可进行基因编辑元件的测试和转化子的快速筛选，尤其是在表达内源基因时，该技术优势非常突出。

摘要： 本说明书实施例公开了一种表达载体，其包括载体骨架，所述载体骨架不含大肠杆菌复制子；及控制拷贝单元，所述控制拷贝单元包括ori2区、oriV区、sopA基因、sopB基因、inCC区和repE基因。本说明书实施例还公开了一种构建表达载体的方法。本说明书实施例公开的表达载体可高效克隆毒性基因。

摘要： 本发明提出了一种植物表达载体pCAMBIA1304-hpa1xoo的构建方法，构建过程中，采用间接载体进行构建，具体为通过对pCAMBIA1304载体和pCAMBIA2301载体进行重组成pCAMBIA1304-2301中间载体，再将所述中间载体以及含有目标基因片段的载体进行酶切和重组，构建pCAMBIA1304-hpa1xoo表达载体，方法简便，便于推广与应用，得到的表达载体便于筛选与后期实验。

摘要： 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及重组人脂联素表达载体、载体构建方法及表达方法。本发明的重组人脂联素表达载体，包括SEQ ID No.1所示的核苷酸序列和Fc‑GS质粒。所述重组人脂联素表达载体的构建方法，包括：根据人脂联素的氨基酸序列，经密码子优化，得到人脂联素的cDNA序列；所述人脂联素的cDNA序列如SEQ ID No.1所示；设计引物，对所述cDNA序列进行扩增，经鉴定后回收目的片段；将所述目的片段连接至Fc‑GS质粒中，得到重组人脂联素表达载体。将所述重组人脂联素表达载体转染至仓鼠卵巢细胞中，可稳定表达重组人脂联素‑Fc融合蛋白，而且方法简便高效。

摘要： 本发明公开了一种通用型高效真核表达载体p3I－GFPN及采用该载体构建的抗乳腺炎的转基因载体，本发明构建的抗乳腺炎转基因载体pCMV/CSN2－hLY－hIFA，在乳腺细胞中能高水平表达绿色荧光蛋白，在泌乳期的乳腺细胞中，由于CSN2的启动子发挥了启动作用，使转pCMV/CSN2－hLY－hIFA的乳腺细胞分泌大量的人溶菌酶和人干扰素A，在通过乳汁分离获得目的蛋白的同时又能较好的防治家畜乳腺炎。

摘要： 本发明属于重组蛋白表达技术领域，具体涉及人源化细胞瞬时表达载体、表达系统及其应用。本发明构建的表达载体，引入TRE/TAP组成的反式激活蛋白元件，并且TAP作为独立表达框，相比未引入该元件的表达载体，能够成倍提高目的蛋白瞬时表达量；更进一步的，本发明将TRE/TAP组成的反式激活蛋白元件与核基质结合区元件MAR和IRES复配使用，相互之间协同增效，进一步提高目的蛋白的瞬时表达量。由此，本发明提供的表达载体和表达系统能够应用于制备蛋白类药物。

摘要： 本发明公开了一种AIDA-I表达元件和CMV真核表达元件共表达载体的构建方法，具体包括

摘要： 本发明提供了一种线性化表达载体构建方法及用于线性化表达载体构建的类载体片段，本发明的线性化表达载体构建方法包括下列步骤：设计并构建前类载体片段、后类载体片段及目的基因片段；将前类载体片段、后类载体片段及目的基因片段采用连接酶连接获得线性双链DNA表达载体。本发明还进一步提供了用于线性化表达载体构建的类载体片段。本发明通过高效准确的连接反应制备类似线性化载体片段，避开了通过繁琐耗时的环状质粒载体的构建而获得线性化载体片段的过程，同时目的基因末端的产生不受其序列的限制可以极大简化操作、降低成本并缩短实验周期，在酵母等表达系统中具有很好的应用前景。

摘要： 本发明提供了一种线性化表达载体构建方法及用于线性化表达载体构建的类载体片段，本发明的线性化表达载体构建方法包括下列步骤：设计并构建前类载体片段、后类载体片段及目的基因片段；将前类载体片段、后类载体片段及目的基因片段采用连接酶连接获得线性双链DNA表达载体。本发明还进一步提供了用于线性化表达载体构建的类载体片段。本发明通过高效准确的连接反应制备类似线性化载体片段，避开了通过繁琐耗时的环状质粒载体的构建而获得线性化载体片段的过程，同时目的基因末端的产生不受其序列的限制可以极大简化操作、降低成本并缩短实验周期，在酵母等表达系统中具有很好的应用前景。