草鱼呼肠孤病毒

摘要： 1草鱼出血病的流行病学1.1草鱼出血病的发现1980年发现病毒颗粒并确认为草鱼出血病病原,1991年国际病毒分类委员会将其命名为草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus,GCRV)。GCRV是中国分离鉴定的第一株鱼类病毒,是水生呼肠孤病毒属中致病力最强的毒株,不仅能感染草鱼,而且还能感染青鱼、麦穗鱼、布氏鳖条鱼等,并能使这几种鱼发生出血病症状而死亡。

摘要： 目的对一例典型草鱼出血病的病原进行分离、鉴定和全基因组序列分析。方法采用细胞培养分离病毒、PCR检测和测序分析、电镜观察、间接免疫荧光(IFA)分析、全基因组序列测定及回归感染鉴定对采集的草鱼出血病样品进行病原分析。结果接种病毒的细胞没有产生CPE,但电镜观察可见大量呈典型呼肠孤病毒特点的病毒粒子,PCR检测并测序分析和IFA鉴定表明该分离株为II型GCRV;分离的病毒感染草鱼可出现典型的草鱼出血病症状,最终死亡率为96.7%,暂命名为GD20-08株;全基因组测序表明,GD20-08的基因组结构Ⅱ型GCRV分离株的相似,其核苷酸和氨基酸序列其他Ⅱ型GCRV分离株的同源性分别在94%~99%和96%~100%不等。结论从患草鱼出血病的草鱼体内分离到一株Ⅱ型GCRV的变异强毒株。

摘要： 草鱼病毒性出血病由草鱼呼肠孤病毒感染引起,是对草鱼养殖危害最严重的疾病.本文从典型症状、组织病理学特征、基因型、病因等方面对草鱼病毒性出血病的流行情况进行剖析,并提出了针对性的防控措施,以期为草鱼健康养殖提供借鉴.

摘要： 为研究草鱼I型呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)非结构蛋白NS12的功能,实验利用酵母双杂交实验、GST融合蛋白沉降技术(GST pull-down)和对GCRV感染过表达宿主蛋白酶体亚基β7(proteasome subunit beta type 7,PSMB7)的草鱼卵巢细胞(grass carp ovarian cell,GCO)中ns12转录水平的表达量进行实时荧光定量PCR检测,研究PSMB7和NS12的相互作用.酵母双杂交实验结果表明,PSMB7与GCRV编码的膜相关的非结构蛋白NS12也存在着潜在相互作用.GST-pull-down检测结果证实PSMB7与GCRV编码的膜相关的非结构蛋白NS12存在相互作用;PSMB7过表达能够上调ns12在病毒感染过程中的转录水平表达量;免疫印迹验证NS12对于蛋白降解并不敏感.本实验室先前研究证实PSMB7在病毒感染过程中表达恒定.综上所述,这些结果揭示GCRV NS12与PSMB7存在分子间相互作用,但并没有作为PSMB7的底物.表明其可能竞争性地阻碍蛋白酶体复合物的形成.病毒蛋白干扰蛋白酶体复合物胞内PSMB7的积累可能是其一种针对蛋白酶体介导的先天免疫的免疫逃逸策略.

摘要： 一、草鱼出血病1.病原体:为一种草鱼呼肠孤病毒。2.症状及病变:病鱼体色暗黑而带微红色,小的鱼种在阳光或灯光透视下,可见皮下充血发红。口腔、眼眶、头顶、下颚、鳃盖、鳍条基部充血,甚至眼球突出。将病鱼皮肤剥除,肌肉显示点状或块状充血,严重时全身肌肉呈鲜红色。严重出血的病鱼可出现"白鳃"或呈斑点状充血,但有些病鱼鳃瓣无明显症状。

摘要： [目的]研究草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)096 vp7基因的原核和真核表达及其编码蛋白的免疫原性.[方法]应用RT-PCR技术获得GCRV 096 vp7基因,构建GCRV 096 vp7基因原核表达载体pET-VP7,用原核表达的GCRV 096 VP7蛋白免疫草鱼(Ctenopharyngodon idellus)15 d后,用GCRV 096和GCRV GD108分离株对其攻毒,检测GCRV 096 VP7的免疫原性.构建GCRV 096 vp7基因真核表达载体pEGFP-N3-VP7,分析其在草鱼CIK细胞中的表达.[结果与结论]GCRV 096 vp7基因的开放阅读框ORF(GenBank登录号为JN206665)为831 bp,编码276个氨基酸.成功构建GCRV 096 vp7基因原核表达载体pET-VP7,并在大肠杆菌BL21中诱导表达成功;最优表达条件是0.2 mm/L IPTG、28°C下表达5 h,通过HisTrap HP柱纯化融合蛋白,Western blot分析结果表明,所表达的蛋白为目的蛋白.经免疫及GCRV攻毒后,GCRV 096(Ⅰ型)免疫组vp7基因的表达水平降低(P<0.05),而GCRV GD108(Ⅱ型)免疫组vp7基因的表达无显著差异,表明GCRV 096 VP7蛋白对GCRV 096具有良好的免疫效果,但对GCRV GD108无明显的免疫效果.成功构建GCRV 096 vp7基因真核表达载体pEGFP-N3-VP7,Western blot分析结果表明,GCRV 096 VP7蛋白在草鱼肾(CIK)细胞中成功表达.

摘要： 9月份,全国各地气温开始下降,昼夜温差增加,这一时期,养殖水体的载鱼量、投饵量达到全年的高峰,池塘水质易恶化,容易诱发各类养殖水生动物疾病。今年9月份全国各地需重点关注以下疾病。病情预测(一)鱼类疾病1.草鱼出血病:病原为草鱼呼肠孤病毒,主要危害草鱼鱼种,水温在20°C~30°C时易发病,25°C~28°C为流行高峰,主要传播途径是水平传播,也可能通过鱼卵进行垂直传播。各草鱼主养区需重点防控。

摘要： 由草鱼呼肠孤病毒引起的草鱼出血病给我国淡水鱼养殖造成了巨大的经济损失。变异迅速和复杂的病原学是导致其流行的主要原因，根据已发表的全基因组或部分节段基因序列信息，总体上可以将草鱼呼肠孤病毒分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ三个类型。本研究针对各类型毒株的保守区域分别设计三对引物，优化反应条件和体系，建立了草鱼呼肠孤病毒三重RT-PCR检测方法，通过PCR扩增获得大小约为530bp、297bp和196bp的DNA片段。进一步分析表明该检测方法具有良好的扩增效率、特异性和稳定性，该方法的建立对草鱼出血病的快速诊断和分子流行病学调查具有重要意义。用建立的多重RT-PCR方法对2008-2011年采集自江西、广东、湖北、浙江、重庆、四川、福建等草鱼主养区的86份草鱼出血病样品进行检测和初步流行病学分析。结果表明，Ⅰ型阳性率为9_3%，Ⅱ型阳性率为45_3%，Ⅲ型阳性率为2-3%，Ⅰ型和Ⅱ型混合感染阳性率为5.8%，Ⅱ和Ⅲ型混合感染阳性率为2.3%，其它类型的混合感染未检测到，表明目前主要流行的草鱼呼肠孤病毒为Ⅱ型。

摘要： 本发明公开了一种用于鉴定新型鸭呼肠孤病毒和新型鹅呼肠孤病毒的检测试剂盒及其应用，该试剂盒基于SEQ ID NO:3所示的探针和SEQ ID NO:1～2所示的引物对构成。基于该检测试剂盒的检测方法检测速度快且高通量，对于新型鸭呼肠孤病毒和新型鹅呼肠孤病毒具有较好的特异性，对于新型鸭呼肠孤病毒的最低检测限可达到17.8copies，对于新型鹅呼肠孤病毒的最低检测限可达到35.3copies。该检测方法对于新型鸭呼肠孤病毒和新型鹅呼肠孤病毒的监测和防控具有极为重要的意义。

摘要： 本发明公开了一种用于鉴定新型鸭呼肠孤病毒和新型鹅呼肠孤病毒的检测试剂盒及其应用，该试剂盒基于SEQ ID NO:3所示的探针和SEQ ID NO:1～2所示的引物对构成。基于该检测试剂盒的检测方法检测速度快且高通量，对于新型鸭呼肠孤病毒和新型鹅呼肠孤病毒具有较好的特异性，对于新型鸭呼肠孤病毒的最低检测限可达到17.8copies，对于新型鹅呼肠孤病毒的最低检测限可达到35.3copies。该检测方法对于新型鸭呼肠孤病毒和新型鹅呼肠孤病毒的监测和防控具有极为重要的意义。

摘要： 本发明属于生物技术领域，具体公开了，一种共表达草鱼呼肠孤病毒外衣壳蛋白VP4和VP35的重组杆状病毒的制备方法和应用。将SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.2所示序列顺序插入到pFastBacTMⅠ的BamHⅠ和EcoR I酶切位点之间，得到重组质粒pFastBac‑S11‑T2A‑S6，最终获得可表达草鱼呼肠孤病毒外衣壳蛋白VP4和VP35的重组杆状病毒，该重组病毒表达量高，制备的蛋白适合用于草鱼呼肠孤病毒病疫苗的生产，具备广阔的应用前景。

摘要： 本发明提供了一种高效双表达草鱼呼肠孤病毒外衣壳蛋白VP5和VP7的重组病毒vAcGCRV-VP5/VP7，其构建方法是：通过RT-PCR扩增，分别得到2条编码GCRV外衣壳蛋白VP5和VP7基因的特异片段；通过基因克隆筛选获得插入了GCRV VP5与VP7基因的双表达载体pFbDGCRV-VP5/VP7，然后将其转化DH10Bac细胞，再转染Sf9昆虫细胞即可。本发明通过杆状病毒表达系统，在体外成功构建了同时表达GCRV VP5和VP7外衣壳蛋白双表达载体，并获得在Sf9细胞中的高效表达，子代病毒的增殖培养证实其高效表达的稳定特性；其表达蛋白能用于研究GCRV外衣壳蛋白功能及制备基因工程疫苗。

摘要： 本发明涉及草鱼出血病的病原草鱼呼肠孤病毒RT-PCR快速检测试剂盒及检测方法。本发明所述的草鱼出血病的病原草鱼呼肠孤病毒的RT-PCR快速检测试剂盒，包括：2×反应混合缓冲液1.0ml，包含优选设计的上游引物和下游引物；酶混合液；无RNA酶的去离子水；阳性对照液；阴性对照液。本发明克服了现有草鱼出血病RT-PCR检测方法无法检测当前流行毒株的不足，提供了一种新型的RT-PCR快速检测试剂盒及其检测方法，能快速、高效地适用于目前多数流行毒株的检测。

摘要： 本发明属于生物技术领域，具体公开了，一种共表达草鱼呼肠孤病毒外衣壳蛋白VP4和VP35的重组杆状病毒的制备方法和应用。将SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.2所示序列顺序插入到pFastBacTMⅠ的BamHⅠ和EcoR I酶切位点之间，得到重组质粒pFastBac‑S11‑T2A‑S6，最终获得可表达草鱼呼肠孤病毒外衣壳蛋白VP4和VP35的重组杆状病毒，该重组病毒表达量高，制备的蛋白适合用于草鱼呼肠孤病毒病疫苗的生产，具备广阔的应用前景。

摘要： 本发明涉及生物技术领域，特别涉及表达草鱼呼肠孤病毒刺突蛋白VP56的重组杆状病毒及应用。重组杆状病毒为构建pFast‑HTA‑VP56重组质粒并转化至杆状病毒中所产生。本发明通过构建pFast‑HTA‑VP56质粒，利用杆状病毒表达系统，重组表达了带有his标签蛋白的草鱼呼肠孤病毒刺突蛋白VP56可溶蛋白的杆状病毒，利用此杆状病毒可以感染SF9(昆虫细胞)大量的表达可溶性的VP56蛋白，并应用于分子病毒学的相关操作。

摘要： 本发明涉及生物技术领域，特别涉及表达草鱼呼肠孤病毒刺突蛋白VP55的重组杆状病毒及应用。重组杆状病毒为构建pFast‑HTA‑VP55重组质粒并转化至杆状病毒中所产生。本发明通过构建pFast‑HTA‑VP55质粒，利用杆状病毒表达系统，重组表达了带有his标签蛋白的草鱼呼肠孤病毒刺突蛋白VP55可溶蛋白的杆状病毒，利用此杆状病毒可以感染SF9(昆虫细胞)大量的表达可溶性的VP55蛋白，并应用于分子病毒学的相关操作。

摘要： 本发明涉及一种检测II型草鱼呼肠孤病毒疫苗中病毒含量的试剂盒及方法，进一步地涉及活疫苗或灭活疫苗(病毒灭活前)的病毒含量的测定，所述试剂盒包括用于检测基因II型GCRV VP41的血清抗体、FITC标记的羊抗兔IgG、阳性对照样品、固定液和PBS洗液。检测方法为将活疫苗或灭活疫苗(病毒灭活前)进行梯度稀释后接种于PSF细胞，连续培养完成后再用本发明所述的试剂盒进行免疫荧光检测，将检测结果进行计算得出相应的病毒含量。本发明的试剂盒及方法灵敏度高、特异性强，且能定量检测活病毒。

摘要： 本发明提供了一种高效双表达草鱼呼肠孤病毒外衣壳蛋白VP5和VP7的重组病毒vAcGCRV－VP5/VP7，其构建方法是：通过RT－PCR扩增，分别得到2条编码GCRV外衣壳蛋白VP5和VP7基因的特异片段；通过基因克隆筛选获得插入了GCRV VP5与VP7基因的双表达载体pFbDGCRV－VP5/VP7，然后将其转化DH10Bac细胞，再转染Sf9昆虫细胞即可。本发明通过杆状病毒表达系统，在体外成功构建了同时表达GCRVVP5和VP7外衣壳蛋白双表达载体，并获得在Sf9细胞中的高效表达，子代病毒的增殖培养证实其高效表达的稳定特性；其表达蛋白能用于研究GCRV外衣壳蛋白功能及制备基因工程疫苗。