DAS-ELISA

摘要： 为了解湖南省马铃薯种薯质量和主要病毒病发生情况,2019年-2020年马铃薯秋作和冬作期间,对长沙、益阳、湘潭、澧临等马铃薯生产区的155个马铃薯样品,运用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)和双抗体夹心酶联免疫吸附检测(DAS-ELISA)技术,筛查6种主要马铃薯病毒,包括马铃薯X病毒Potato virus X(PVX)、马铃薯Y病毒Potato virus Y(PVY)、马铃薯M病毒Potato virus M(PVM)、马铃薯S病毒Potato virus S(PVS)、马铃薯A病毒Potato virus A(PVA)、马铃薯卷叶病毒Potato leaf roll virus(PLRV)。检测结果表明:6种马铃薯病毒病在湖南均有不同程度的发生,单一和两种病毒复合感染植株占比最高,其次是3种病毒复合感染,存在极少数植株复合感染4~5种病毒病情况。在秋作马铃薯中,PVY检出率达到29.41%;PVS和PVA检出率均为27.94%;PVM、PVX、PLRV的检出率分别为20.59%、19.12%、17.65%。在冬作马铃薯中,PVX检出率最高,达到31.03%;其次是PLRV,检出率为25.29%;PVS、PVM、PVA、PVY的检出率依次为19.54%、16.09%、10.34%、5.75%。综上所述,近年来湖南地区马铃薯病毒病发生有抬头之势,其中PVX和PVY最为严重,复合感染增加,受天气和种源影响,秋作马铃薯比冬作马铃薯情况严重。

摘要： 目的建立副溶血弧菌耐热直接溶血素的双抗体夹心ELISA(double antibody sandwich ELISA,DAS-ELISA)检测方法。方法本研究通过PCR技术扩增副溶血弧菌耐热直接溶血素基因序列,并将其克隆至pET-28a载体后进行原核表达,对表达蛋白进行纯化和鉴定,随后用高纯度的重组蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,得到抗体后利用分子互作测定抗体的亲和力,并利用该抗体建立检测副溶血弧菌耐热直接溶血素的DAS-ELISA方法。通过棋盘法对该方法的反应条件进行优化,建立标准曲线,并对建立的DAS-ELISA方法进行性能评价及初步应用。结果本实验制备的多克隆抗体亲和力可达1×10^(-8),使用该高亲和力抗体建立的DAS-ELISA方法灵敏度为78 ng/mL,定量范围为78~312 ng/mL;与创伤弧菌溶细胞毒素(Vibrio vulnificus hemolysin,VVH)、产气荚膜梭菌α毒素(Clostridium perfringensαtoxin,CPA)以及产气荚膜梭菌ε毒素(epsilon toxin,ETX)均无交叉反应;利用扇贝、花蛤和魁蚶制备海鲜模拟样本,在上述3种模拟样本内添加重组蛋白构建标准曲线,评价本方法复杂基质中检出能力时发现灵敏度均并未发生改变;同时在上述3种模拟样本中添加菌液上清评价本方法检测天然毒素能力,检出率为100%。结论成功构建了一种用于副溶血弧菌耐热直接溶血素检测的DAS-ELISA方法,该方法特异性强、灵敏度高,适用于复杂基质检测,有望开发成副溶血弧菌耐热直接溶血素快速诊断试剂盒,具有良好的应用前景。

摘要： 为了制备出马铃薯卷叶病毒(PLRV)与S病毒(PVS)重组双CP多克隆抗体并用于PLRV与PVS这2种病毒的间接与DAS-ELISA检测,构建了PLRV与PVS融合双CP基因的原核表达载体pET22b-LRCP/SCP,用超声破碎法代替溶菌酶法裂解重组菌BL21(pET22b-LRCP/SCP)并提取菌体蛋白,用镍离子亲和层析纯化获得了分子质量为51.2 ku的高纯度的重组双CP。用该重组双CP作抗原免疫家兔获得了高效价(1∶128 k)抗血清。纯化的重组双CP多克隆抗体与PLRV或PVS阳性标准物特异性结合,与另外4种马铃薯主要病毒(PVX、PVY、PVA与PVM)无交叉反应。间接ELISA反应中,稀释度为1∶3200的重组双CP多克隆抗体与PLRV或PVS阳性物都呈现阳性反应;在DAS-ELISA反应中,稀释度均为1∶100的重组双CP多克隆抗体及其碱性磷酸酶标记物与PLRV或PVS的阳性标准物也分别呈现阳性反应。结果表明,制备的重组双CP抗体既可用于PLRV与PVS这2种病毒的间接ELISA检测,也可用于DAS-ELISA检测。

摘要： 为调查广东省国兰病毒病发生情况,采用双抗体夹心-酶联免疫吸附测定(double sandwich enzyme-linked immunosorbent assay,DAS-ELISA)法对采集自广州市、汕头市和韶关市兰花主产区的53份具有典型病毒病症状的国兰叶片进行检测,选取35份病叶应用RT-PCR技术对检测结果进行验证,并基于cp基因序列对检测到的病毒进行系统进化分析.DAS-ELISA检测结果显示,53份病叶中有44份检出病毒,总检出率为83.02％;其中,有14份仅检出建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,CymMV),有19份仅检出齿兰环斑病毒(Odontolossum ring spot virus,ORSV),有11份检出CymMV和ORSV复合侵染,检出率分别为26.42％、35.85％和20.75％.RT-PCR检测结果显示,35份病叶中有30份检出病毒,总检出率为85.71％;其中,有21份仅检出CymMV,有6份仅检出ORSV,有4份检出CymMV和ORSV复合侵染,检出率分别为60.00％、17.14％和11.43％,但未检测到其它病毒.表明广东省国兰病毒病害主要由CymMV和ORSV侵染引起.序列和系统进化分析显示,来源于不同地区和寄主的CymMV和ORSV分离物的cp基因序列极为保守,CP氨基酸序列相似性分别大于97.31％和93.67％,且CymMV和ORSV多样性种群的分化与寄主种属和地理隔离关系不大.

摘要： 为明确我国辣椒病毒病的种类和发展趋势,2018年和2019年在我国16个省(市、自治区)辣椒主产区采集具有病毒病疑似症状的样品105份,利用双抗体夹心酶联免疫吸附反应(DAS-ELISA)对12种辣椒主要病毒进行检测.结果表明,有70份样品为病毒病感染样品,病毒检出率为66.67％.检出病毒种类共10种,其中辣椒轻斑驳病毒(Pepper mild mottle virus,PMMoV)检出率最高,为24.76％,其次为黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)、蚕豆萎蔫病毒(Broad bean wilt virus,BBWV)、烟草蚀纹病毒(Tobacco etch virus,TEV)和番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus,TSWV),检出率分别为19.05％、12.38％、12.38％ 和10.48％.我国辣椒主产区多种病毒复合侵染发生较为普遍,病毒复合侵染率为40％,其中以2种病毒复合侵染比例最高,为28.57％.通过对两年辣椒病毒病检测结果进行比较,12种病毒中有7种检出率有上升趋势.总体而言,PMMoV和CMV为近两年危害我国辣椒生产较为严重的病毒病;此外,PMMoV、BBWV-1,2、TEV、TSWV具有流行风险,需要严加防范.

摘要： 为建立一种针对Cry1类毒素的经济高效的检测方法,本研究以杂交瘤细胞株2D10 cDNA为模板,通过重叠延伸PCR(gene splicing by overlap extension PCR,SOE-PCR)技术构建单链抗体(single-chain variable fragment,scFv)基因,转入大肠杆菌(Escherichia coli) BL21 (DE3)表达并建立双抗体夹心酶联免疫吸附测定(double antibody sandwich ELISA,DAS-ELISA)检测方法,通过分子对接模拟分析影响scFv与Cry1A类毒素结合的关键因素.结果成功构建了scFv基因,表达纯化出具有较高识别活性的scFv抗体(约28 kD),所建立的DAS-ELISA方法对Cry1Ab/Cry1Ac毒素的最低检测限(limits of determination,LOD)为20 ng/mL,分子对接结果显示,毒素的三维结构决定了其结合活性,氢键和疏水作用力在scFv与毒素结合过程中起重要作用.本研究利用基因工程抗体技术构建并表达获得了scFv抗体,建立了针对Cry1Ab/Cry1Ac毒素的双抗夹心ELISA检测方法,初步分析研究了scFv与Cry1Ac/Cry1Ab和Cry1Aa的识别差异机制,为进一步改造、研究开发新型广谱scFv提供了理论依据.

摘要： 采用双抗体夹心酶联免疫吸附法(DAS-ELISA)和RT-PCR法,对甘肃省农业科学院蔬菜研究所试验地的辣椒病毒病病原进行检测.结果表明:在72份病样中,烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)的总检出率为66.7%,没有检出黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV).设计3对TMV引物对阳性样品进行扩增,其中引物TMV1扩增出相似片段目的条带,经BLASTN比对与番茄斑驳花叶病毒(Tomato mottle mosaic virus,ToMMV)的序列一致性为97%.针对ToMMV设计3对引物进行扩增,均扩增出单一且与预期大小相同的目标条带,经测序后与ToMMV的序列一致性为98%以上,证明发生在甘肃省农业科学院蔬菜研究所试验地的辣椒病毒病病原为番茄斑驳花叶病毒.%Using DAS-ELISA and RT-PCR methods,this study identified pepper pathogenetic virus in experimental fields of Vegetable Insititute,Gansu Academy of Agricultural Sciences. The results showed that in 72 disease infected samples,the total TMV detection rate was 66.7%,whereas CMV had not been detected as positive. Three pairs of primers were designed to amplify positive samples. A strip with similar segments was amplified only from primer TMV1,which had 97% sequence similarity with ToMMV by BLASTN comparison. Aiming at ToMMV,3 pairs of primers ToMMV1,ToMMVcp and ToMMVspe were designed to amplify ToMMV. A single target band with same size as expected was amplified. Its sequence was 98% accorded with ToMMV by sequencing,proving the virus found in the experimental fields of Vegetable Insititute was truly ToMMV.

摘要： 利用双抗体夹心-酶联免疫吸附试验(double antibody sandwich enzymelinked immunosorbent assay,DAS-ELISA)和反转录-聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)方法对来自土耳其的番茄种子进行种传病毒检测.结果表明,在该批番茄种子中检测到番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus,TSWV),对PCR产物进行测序,扩增片段与其他TSWV分离物的核苷酸序列相似度为99％～ 100％,证实该批番茄种子携带TSWV.

摘要： Objective:To find the potential tumor marker of pancreatic cancer and establish its sandwich ELISA system,and apply it to the detection of the serum of patients with pancreatic cancer.Methods:MALDI-TOF-MS was used to analyze the serum of preoperative and postoperative pancreatic cancer patients.The DAP44 protein was purified and purified by hybridoma technique.The anti-DAP44 monoclonal antibody was prepared by hybridoma technique.The antibody titer was detected by HRP labeling method.Antibody titer was detected by indirect ELISA.Histopathological staining of pancreatic cancer tissue and adjacent tissue was performed with the prepared antibodies.Anti-DAP44 kit was prepared by sandwich ELISA (DAS-ELISA) Pancreatic cancer patients and normal serum DAP44 values,compared the difference.Results:The differential protein peaks of preoperative and postoperative pancreatic cancer were detected and collected.Peptide sequencing and bioinformatics analysis were performed on the differentially expressed proteins.Three hybridoma cells stably secreting monoclonal antibodies against DAP44 (2D6H5,1E4D6,5B8H12,3) hybridoma cells secreted antibody titers above 107,by antibody matching screening to determine 2D6H5 as coating antibodies,1E4D6 for the enzyme labeled antibody.The results of histochemical staining showed that the expression of DAP44 in cancer tissues was much higher than that in adjacent tissues.The linear range of DAS-ELISA was 0.78-25ng / ml and 0.78ng / ml,respectively.The detection of DAP44 in pancreatic cancer and The average content of DAP44 in normal group was 19.707 ± 1.464 and 10.653 ± 2.221,respectively.There was significant difference between the two groups (P ＜0.001).Conclusion:DAP44 could be used as a potential marker for the pancreatic cancer.The established anti-DAP44 DAS-ELISA system could be used for the clinical diagnosis and assessment of curative effect of pancreatic cancer.%目的:探索胰腺癌新的潜在标志物,建立夹心法ELISA体系,并初步应用于胰腺癌患者的血清检测.方法:应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术对胰腺癌患者术前后血清进行分析,提纯分析差异蛋白并命名为DAP44,通过杂交瘤技术制备出抗DAP44单克隆抗体,用HRP标记法标记抗体,间接ELISA法检测抗体滴度,用制备出的抗体对胰腺癌组织和癌旁组织进行组化染色,采用夹心ELISA(DAS-ELISA)法制备抗DAP44检测试剂盒,检测胰腺癌病人和正常人血清DAP44值,比较两者差异.结果:对差异蛋白进行肽段测序和生物信息分析,并融合了3株能稳定分泌抗DAP44单克隆抗体的杂交瘤细胞(2D6H5,1E4D6,5B8H12),3株杂交瘤细胞分泌的抗体效价均在107以上,通过抗体配对筛选确定以2D6H5为包被抗体,1EAD6为酶标抗体时,DAS-ELISA法敏感性最高.两株抗体组化染色结果显示:癌组织DAP44表达量远高于癌旁.DAS-ELISA法标准曲线线性范围在0.78-25 ng/mL,检测下线为0.78 ng/mL,此方法检测到的胰腺癌病人和正常人血清DAP44平均含量分别为19.707± 1.464和10.653± 2.221,两者之间有统计学差异(P＜0.001).结论:DAP44可能作为潜在的胰腺癌肿瘤标志物,建立的抗DAP44 DAS-ELISA法体系能够初步用于胰腺癌的临床诊断和疗效评估指标.

摘要： 本文采用指示植物分离马铃薯主要病毒的毒源材料,并扩繁病毒,繁毒材料经差速离心PEG沉淀和蔗糖密度梯度离心,得到纯病毒,病毒免疫家兔,从家兔身上提病毒抗血清,抗血清经IgG纯化和酶标记IgG后测出适宜工作浓度,按照DAS-ELISA检测中所用试剂进行各缓冲液的混配、分装,与稀释好的IgG和酶标记IgG组装成完整的马铃薯主要病毒检测试剂.

摘要： 本文采用指示植物分离马铃薯主要病毒的毒源材料,并扩繁病毒,繁毒材料经差速离心PEG沉淀和蔗糖密度梯度离心,得到纯病毒,病毒免疫家兔,从家兔身上提病毒抗血清,抗血清经IgG纯化和酶标记IgG后测出适宜工作浓度,按照DAS-ELISA检测中所用试剂进行各缓冲液的混配、分装,与稀释好的IgG和酶标记IgG组装成完整的马铃薯主要病毒检测试剂.

摘要： 本文采用指示植物分离马铃薯主要病毒的毒源材料,并扩繁病毒,繁毒材料经差速离心PEG沉淀和蔗糖密度梯度离心,得到纯病毒,病毒免疫家兔,从家兔身上提病毒抗血清,抗血清经IgG纯化和酶标记IgG后测出适宜工作浓度,按照DAS-ELISA检测中所用试剂进行各缓冲液的混配、分装,与稀释好的IgG和酶标记IgG组装成完整的马铃薯主要病毒检测试剂.

摘要： 本文采用指示植物分离马铃薯主要病毒的毒源材料,并扩繁病毒,繁毒材料经差速离心PEG沉淀和蔗糖密度梯度离心,得到纯病毒,病毒免疫家兔,从家兔身上提病毒抗血清,抗血清经IgG纯化和酶标记IgG后测出适宜工作浓度,按照DAS-ELISA检测中所用试剂进行各缓冲液的混配、分装,与稀释好的IgG和酶标记IgG组装成完整的马铃薯主要病毒检测试剂.

摘要： 本文采用指示植物分离马铃薯主要病毒的毒源材料,并扩繁病毒,繁毒材料经差速离心PEG沉淀和蔗糖密度梯度离心,得到纯病毒,病毒免疫家兔,从家兔身上提病毒抗血清,抗血清经IgG纯化和酶标记IgG后测出适宜工作浓度,按照DAS-ELISA检测中所用试剂进行各缓冲液的混配、分装,与稀释好的IgG和酶标记IgG组装成完整的马铃薯主要病毒检测试剂.