脑心肌炎病毒

摘要： 为了探究三方基序蛋白25(TRIM25)对脑心肌炎病毒(encephalomyocarditis virus,EMCV)增殖的影响,在HEK-293T细胞上使用簇状规则间隔的短回文重复序列(CRISPR/Cas9)基因编辑技术敲除TRIM25基因,并通过PCR测序和Western blot确认敲除效果,然后观察敲除细胞形态并利用试剂盒测定TRIM25缺失后细胞增殖速度的变化,确认敲除细胞与野生细胞无明显差异,用EMCV感染敲除细胞后,采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)、病毒滴定测定和Western blot等方法测定病毒基因转录水平、蛋白表达情况。结果显示:感染EMCV后,敲除细胞与野生细胞相比,显著促进了病毒的转录水平、病毒蛋白的翻译水平和子代病毒的毒力(P<0.05)。综上,在HEK-293T细胞上,成功构建TRIM25缺失细胞系,且试验表明TRIM25的缺失有助于EMCV的复制。研究结果为后续TRIM25抗病毒机制研究提供了理论依据。

摘要： 脑心肌炎病毒是一种重要的人畜共患病病原,为了初步研究EMCV介导的天然免疫反应的分子机制,将VP1蛋白克隆至真核表达载体pCMV-HA,转染HEK293细胞后,使其在细胞内过表达,通过ELISA和实时荧光定量PCR检测VP1过表达对IFN-β表达和RLRs信号通路相关因子,以及下游刺激基因表达的影响.结果表明,VP1蛋白可显著抑制IFN-β的表达.进一步研究发现,VP1可显著抑制EMCV引起的RLRs信号通路相关因子mRNA水平(P<0.01),并且随着VP1的表达,MAVS蛋白的表达明显减少,但对MDA5表达无影响.实验数据初步表明,VP1蛋白可以通过抑制MAVS的表达,进而抑制Ⅰ型IFN基因的表达并阻断其下游信号通路发挥作用.

摘要： 目的:建立一种干扰素诱导跨膜蛋白2(IFITM2)基因SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法,以期为IFITM2基因的动态监测提供有效的检测技术.方法:根据GenBank中公布的IFITM2基因序列设计特异性引物,以质粒pMD18-T-IFITM2为模板进行条件优化,绘制标准曲线,建立IFITM2基因SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法,并对建立的方法进行条件优化与评价,用建立的方法对脑心肌炎病毒感染后细胞中IFITM2基因转录水平进行检测.结果:建立的20μL检测体系中IFITM2基因最佳引物浓度为10μM,最佳退火温度为59°C;标准质粒在2.62×105～2.62×1010 copies/μL浓度范围内与Ct值呈良好线性关系,线性方程y=-3.495 logx+43.12,R2=0.998,且灵敏性、特异性和重复性均较高.应用建立的方法对EMCV感染细胞中IFITM2基因转录水平进行检测,结果显示,在感染早期IFITM2转录水平不变,感染后期转录水平逐渐升高.EMCV感染引起宿主IFITM2基因转录水平的变化,可能与EM-CV逃逸宿主相关免疫应答有关.结论:成功建立了一种快速、准确检测IFITM2基因的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法.该方法的建立,为进一步研究IFITM2在EMCV感染过程中的作用奠定了基础.

摘要： 目的 探讨DDX56解旋酶在脑心肌炎病毒(encephalomyocarditis virus,EMCV)感染A549细胞复制增殖过程中的调控作用.方法 通过免疫印迹法、qPCR以及TCID50检测上调/下调A549细胞中DDX56并接种EMCV病毒,以空载组为对照组,分析其对病毒增殖的影响及对病毒感染引起的RLRs信号通路中关键接头蛋白活化的影响.结果 A549细胞接种EMCV后,DDX56蛋白水平表达量逐步递增.过表达DDX56可以促进EMCV在宿主细胞中的增殖,干扰DDX56可以抑制EMCV在宿主细胞中的增殖.并且DDX56通过负调控RLRs信号通路中接头分子MAVS、TBK1、IRF3的活化实现对EMCV复制的正调控作用.结论 DDX56促进EMCV增殖是通过抑制RLRs信号通路中接头蛋白的活化来实现的,为EMCV感染的固有免疫应答和调控研究奠定理论基础.

摘要： 脑心肌炎病毒(EMCV)可感染人和多种动物,其基因组先导蛋白编码区是比较保守的区域之一,含有两种高度保守的功能域,即锌指基序和酸性结构域.研究表明,先导蛋白基因组具有一定的容纳外源基因片段的能力,同时先导蛋白与病毒复制 、干扰素产生以及细胞凋亡等均有关系.论文综述了EMCV先导蛋白结构与功能的研究进展.

摘要： 脑心肌炎病毒(Encphalomyocarditis virus，EMCV)可引起的猪、某些哺乳动物乃至灵长类动物以脑炎、心肌炎或心肌周围炎。本研究以脑心肌炎病毒(Encphalomyocarditis virus,EMCV) HB10株VP2基因为目的基因,建立EMCV快速诊断方法;并对VP2基因进行克隆、测序并用生物信息学技术分析EMCV-HB10-VP2蛋白的糖基化位点、磷酸化位点、信号肽、B细胞抗原表位及其二、三级结构.结果表明,成功克隆了EMCV-HB10-VP2基因;构建重组质粒pEGFP-HB10-VP2,并以此质粒作为阳性模板建立了特异性好、灵敏性高的EMCV快速诊断方法;生物信息学分析表明,EMCV-HB10-VP2蛋白可能存在4个糖基化位点;对磷酸化位点预测:丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸分别有:6个、7个、3个位点可能存在磷酸化;可能存在6个B细胞抗原表位;对EMCV-HB10-VP2蛋白二级结构进行预测,α-螺旋占12.50％,β-折叠区域占27.34％,无规则卷曲占60.16％;三级结构存在多个螺旋和折叠区域,主要以无规则卷曲为主.本研究结果为EMCV临床样本的快速筛检提供技术支持,同时EMCV-HB10-VP2蛋白的生物信息学分析为EMCV分子诊断试剂及基因工程疫苗研究等提供参考.

摘要： 脑心肌炎病毒(EMCV)可引起仔猪的急性致死性心肌炎和母猪的繁殖障碍等疾病,并具有重要公共卫生学意义。本研究采用杂交瘤细胞技术,研制获得18株能稳定分泌抗EMCV抗体的杂交瘤细胞株,细胞培养上清ELISA抗体效价为1:1600～1:6400,小鼠腹水抗体效价达1:1000000.15株单抗的亚类为IgG1,3株单抗的亚类为IgG2b,所有单抗的轻链均为κ型。Western blot结果表明,其中17株能特异性识别病毒VP1蛋白,2B6株能识别病毒VP2蛋白。IFA结果为,11株单抗都能识别EMCV.利用原核表达系统,对VP1蛋白进行截短表达,结果获得41个重组截短蛋白,采用间接ELISA和Western blot精确定位了17株单克隆抗体所识别的抗原表位,结果共鉴定出5个抗原表位:V(2)ENAEK(7)(单抗6E11、7A7和7C9识别),A(17)DFVA(21)(单抗2C8识别),F(19)VAQPVY(25)(单抗1D1、1F3、2A2、2A5、4B2、4B9、4F1、5A1、5A11和5G1识别),P(42)IGAFTVK(49)(单抗1G8和3A9识别)和F(36)YDRSSPIGAFTVKS(50)(单抗4E2识别).选择EMCV VP1单抗7C9进行辣根过氛化物酶标记，应用纯化的EMCV重组VP1蛋白作为包被抗原，通过反应条件优化，建立了检测EMCV抗体的阻断ELISA方法。通过对30份EMCV阴性血清检测，确定其判定标准为:阻断率PI>39.10%时为阳性，PIC29.46%时为阴性，29.46%

摘要： 目的:建立脑心肌炎病毒(EMCV)RT-PCR检测方法,应用于长爪沙鼠、小鼠等实验动物EMCV的检测.方法:根据已发表的EMCV VP1基因序列设计合成引物.建立RT-PCR方法,并对方法的特异性、敏感性、稳定性等进行验证.用该方法检测62只长爪沙鼠、12只小鼠.结果:建立的EMCV RT-PCR检测方法特异、敏感、稳定.以EMCV RNA逆转录产物为模板,所能检测RNA最小模板浓度为4.1pg/μl,可检测病毒最小滴度为10-7.ml-1.经RT-PCR检测,62只沙鼠均为阴性;12只小鼠中有1只EMCV核酸阳性,测序结果与GenBank中EMCV标准株核苷酸序列进行比对,其同源性为85％.结论:建立的脑心肌炎病毒(EMCV)RT-PCR检测方法特异、敏感、稳定,可用于长爪沙鼠、小鼠等实验动物EMCV的检测.

摘要： 为了能快速准确地对猪脑心肌炎进行病原学检测，根据GenBank中发表的猪脑心肌炎病毒(EMCV)3D基因序列，设计合成了1对特异性引物，建立了EMCV的一步法RT-PCR检测方法。通过对该方法的特异性、敏感性和重复性进行试验，结果显示，该方法从EMCV BJC3株中扩增出了与试验设计相符的286 bp的特异性片段，而对猪口蹄疫病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、BHK-21正常细胞的扩增结果均为阴性：对EMCV BJC3株的细胞毒进行检测，其敏感度达到2 TCID50;对10份EMCV BJC3株细胞毒进行重复性检测，结果均一致。应用该方法对207份临床疑似发病猪样品进行检测，结果检出19份阳性，阳性检出率为9.18％。rn 结果表明，所建立的EMCV-步法RT-PCR检测方法特异、灵敏、高效、快速，可用于EMCV的临床检测及流行病学调查。

摘要： 猪脑心肌炎是一种由脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditisvirus,EMCV)引起的猪的一种以脑炎、心肌炎或心肌周围炎，以及母猪的繁殖障碍为主要特征的急性传染病。本文就猪脑心肌炎病毒分子生物学和诊断方法的研究进展进行了综述。

摘要： 为探讨脑心肌炎病毒(EMCV)感染后促炎细胞因子的表达水平、从分子水平深入研究EMCV的致病机制，分别针对小鼠促炎细胞因子IL-1β、TNF-α以及管家基因β-actin的基因序列设计了1对特异性引物和一条探针，构建含有各自引物扩增序列的重组质粒作为阳性标准品，建立了检测IL-1β、TNF-α和β-actin的TaqMan real-time PCR检测方法。该方法线性关系好，两种细胞因子及管家基因标准曲线的相关系数均达到0.998以上：敏感性高，初始模板的检出下限均达到1×101copies/μL：特异性强，只有以总RNA反转录成的cDNA为模板，并加入特异性引物和探针的反应才检测到荧光信号：重复性好，组内与组间的变异系数均小于2％。应用所建立的检测方法，对猪源EMCV GXLC株感染小鼠的脑、心、脾中IL-1β、TNF-α mRNA的表达水平进行了检测。结果表明，本研究建立的TaqMan real-time PCR检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好，可以用于小鼠促炎细胞因子的检测及定量分析。

摘要： mRNA翻译的起动有两种机制：帽结构依赖性的翻译和IRES介导的非帽结构依赖的翻译。在RNA病毒和细胞内的部分mRNA中,蛋白合成的起始是由包含在5’端非翻译区(5’-TuR)结构中的IRES介导的,IRES能够在一些反式作用因子的参与下,募集核糖体40s亚单位,开始mRNA的翻译过程。不同病毒的IRES在结构和功能上,既存在保守性,又有各自的特点。病毒IRES序列在病毒基因的表达、复制和致病性上具有至关重要作用,对病毒IRES功能和调控的研究是当前病毒学研究热点之一。本文概述了近年来RNA病毒IRES的几种分型及各自的特点以及IRES的应用。

摘要： mRNA翻译的起动有两种机制：帽结构依赖性的翻译和IRES介导的非帽结构依赖的翻译。在RNA病毒和细胞内的部分mRNA中,蛋白合成的起始是由包含在5’端非翻译区(5’-TuR)结构中的IRES介导的,IRES能够在一些反式作用因子的参与下,募集核糖体40s亚单位,开始mRNA的翻译过程。不同病毒的IRES在结构和功能上,既存在保守性,又有各自的特点。病毒IRES序列在病毒基因的表达、复制和致病性上具有至关重要作用,对病毒IRES功能和调控的研究是当前病毒学研究热点之一。本文概述了近年来RNA病毒IRES的几种分型及各自的特点以及IRES的应用。

摘要： mRNA翻译的起动有两种机制：帽结构依赖性的翻译和IRES介导的非帽结构依赖的翻译。在RNA病毒和细胞内的部分mRNA中,蛋白合成的起始是由包含在5’端非翻译区(5’-TuR)结构中的IRES介导的,IRES能够在一些反式作用因子的参与下,募集核糖体40s亚单位,开始mRNA的翻译过程。不同病毒的IRES在结构和功能上,既存在保守性,又有各自的特点。病毒IRES序列在病毒基因的表达、复制和致病性上具有至关重要作用,对病毒IRES功能和调控的研究是当前病毒学研究热点之一。本文概述了近年来RNA病毒IRES的几种分型及各自的特点以及IRES的应用。

摘要： mRNA翻译的起动有两种机制：帽结构依赖性的翻译和IRES介导的非帽结构依赖的翻译。在RNA病毒和细胞内的部分mRNA中,蛋白合成的起始是由包含在5’端非翻译区(5’-TuR)结构中的IRES介导的,IRES能够在一些反式作用因子的参与下,募集核糖体40s亚单位,开始mRNA的翻译过程。不同病毒的IRES在结构和功能上,既存在保守性,又有各自的特点。病毒IRES序列在病毒基因的表达、复制和致病性上具有至关重要作用,对病毒IRES功能和调控的研究是当前病毒学研究热点之一。本文概述了近年来RNA病毒IRES的几种分型及各自的特点以及IRES的应用。

摘要： 本发明公开了一种猪脑心肌炎病毒BD2株全长感染性克隆的构建方法及应用。在构建好的猪脑心肌炎病毒BD2株全长感染性克隆的基础上，在编码病毒先导蛋白的L基因中插入猪圆环病毒的ORF2基因，成功构建了一种稳定携带猪圆环病毒2型ORF2基因的脑心肌炎病毒BD2株全长感染性克隆。构建的EMCVBD2株全长感染性克隆以及稳定携带猪圆环病毒2型ORF2基因的脑心肌炎病毒BD2株全长感染性克隆都可以拯救出具有感染性的重组病毒，可应用于疫苗制备及病毒的研究。

摘要： 本发明涉及检测技术领域，具体涉及一种猪脑心肌炎病毒荧光定量PCR(分子信标‑MGB)检测试剂盒及其检测方法，主要包括EMCV PCR反应液和EMCV引物探针的混合液、EMCV酶系、EMCV阴性对照、EMCV阳性对照和EMCV定量标准品。采用该试剂盒可以实现EMCV基因的定量检测。试剂盒的检测灵敏度高，最低检测限为102copies/mL；定量线性范围广，可对103copies/mL～1010copies/mL的猪脑心肌炎病毒基因准确定量；特异性强，与其他12种细菌和猪常见病毒无反应；重复性好，批内和批间变异系数均小于5％；稳定性强，反复冻融8次后102copies/mL的最低检测限参考品100％检出，灵敏度和特异性高，对116批次阳性猪血浆能够100％检出，非常适用于猪病常规疫情监测和猪血来源的生物制品对猪脑心肌炎病毒的检测需求。

摘要： 本发明涉及病毒检测技术领域，特别涉及猪脑心肌炎病毒LAMP检测方法，提取待检样品核酸，反转录制备cDNA作为模板，使用检测引物对进行反应，检测待检样品中是否含有猪脑心肌炎病毒。本发明方法反应时间短，具有高特异性，高灵敏性，良好的稳定性和重复性。

摘要： 本发明公开了一种猪脑心肌炎病毒BD2株全长感染性克隆的构建方法及应用。在构建好的猪脑心肌炎病毒BD2株全长感染性克隆的基础上，在编码病毒先导蛋白的L基因中插入猪圆环病毒的ORF2基因，成功构建了一种稳定携带猪圆环病毒2型ORF2基因的脑心肌炎病毒BD2株全长感染性克隆。构建的EMCVBD2株全长感染性克隆以及稳定携带猪圆环病毒2型ORF2基因的脑心肌炎病毒BD2株全长感染性克隆都可以拯救出具有感染性的重组病毒，可应用于疫苗制备及病毒的研究。

摘要： 本发明公开了一种荧光定量RT‑PCR检测鼠脑心肌炎病毒的引物对、探针、试剂盒及方法，所述检测方法是以鼠的脑组织的cDNA为模板，SEQ ID No:1和SEQ ID No:2为引物，SEQ ID No:3为探针，进行荧光定量RT‑PCR扩增，采集荧光信号。本发明的荧光定量RT‑PCR检测方法可以实现快速、准确、方便快捷、特异性地针对小鼠体内鼠脑心肌炎病毒核酸检测，灵敏度、重复性和特异性都可以保证。

摘要： 本发明属于微生物动物疫苗技术领域，尤其涉及一株低毒力猪源脑心肌炎病毒,将猪脑心肌炎病毒毒株的全长cDNA置于CMV启动子控制下，采用DNA转染系统拯救病毒，获得重组病毒，方法简便易行，成功建立该病毒cDNA感染性克隆，拯救获得病毒，体外复制特性与原始病毒相似，但对小鼠致病性明显减弱，为该病毒致病机制及疫苗研制奠定了重要基础；本申请得到的低毒力猪源脑心肌炎病毒经灭活后制备成疫苗，保护率高达90%，是一种安全且保护率高的灭活疫苗。

摘要： 本发明公开了一种猪脑心肌炎病毒纳米PCR检测试剂盒及其检验方法。所述试剂盒包括5×反转录缓冲液、dNTP Mixture、反转录酶、RNA酶抑制剂和反转录引物，其特征在于所述试剂盒还包括2×NanoPCR Mix、上游引物和下游引物，其中，上游引物的序列为SEQ ID No.1所示，下游引物的序列为SEQ ID No.2所示。该试剂盒可用于检测猪脑心肌炎病毒。本发明还提供了一种采用前述试剂盒进行猪脑心肌炎病毒检测的方法，能够快速、特异的检测猪脑心肌炎病毒，大大提高了猪脑心肌炎病毒的检测效率及猪脑心肌炎病毒的特异性扩增产量。

摘要： 本实用新型公开了一种具有智能记录功能的犬脑心肌炎病毒检测仪，包括壳体，所述壳体的内部固定连接有隔板，所述隔板的正面与壳体的内壁之间从上到下依次固定连接有限位板与垫板，所述垫板的顶部活动连接有试剂管，所述试剂管的顶端贯穿限位板并延伸至限位板的上方，所述壳体的顶部且位于隔板的前方转动连接有箱盖，所述箱盖的内部通过滑槽滑动连接有检测头，且滑槽的内表面固定连接有防滑胶垫，本实用新型涉及病毒检测技术领域。该具有智能记录功能的犬脑心肌炎病毒检测仪，检测头与试剂管均设置有多个，利用连接板与拉杆配合，可同时升降多个检测头，使其接触到病毒，可同时检测并记录多组数据，使用简单方便，效率较高。

摘要： 本实用新型公开了一种犬脑心肌炎病毒快速检测试纸卡，包括硝酸纤维素膜、塑料盖板、样品垫、PVC板、中间垫层、金标结合垫、吸水滤纸，其特征在于：所述PVC板的上部贴附有中间垫层，中间垫层的上部从前至后依次贴附有吸水滤纸、硝酸纤维素膜、金标结合垫、样品垫，硝酸纤维素膜的中部设有检测线包被物和质控线包被物，塑料盖板的下端面贴附在PVC板上，塑料盖板上设有加样孔、观察孔、透气槽，塑料盖板与PVC板之间固定有隔板，隔板将各组中间垫层、吸水滤纸、硝酸纤维素膜、金标结合垫、样品垫分开，本实用新型具有检测时间短、检测成本低廉、能够现场操作等优点。

摘要： 本实用新型公开了一种犬脑心肌炎病毒抗体IPMA检测试剂盒，包括模块盒、操作台、显示屏、底盘，其特征在于：所述模块盒安装在底盘的上方，底盘上方设有矩形的微孔板卡槽，模块盒中部的上方设有凸起的操作台，操作台上设有显示屏、键盘面板、操控面板，显示屏、键盘面板、操控面板与中央处理器相连接，中央处理器通过检测通道与微孔板卡槽相连接，中央处理器的存储接口与存储器相连接，中央处理器、存储器均安装在底盘上，本实用新型具有结构简单、紧凑和使用操作便捷、准确等优点，适合各种犬脑心肌炎病毒现场诊断使用。