胞外蛋白酶

摘要： 康氏菌科(Kangillaceae)是海洋螺杆菌目(Oceanosprillales)下的科级分类单元,包含康氏菌属(Kangiella)、异康氏菌属(Aliikangiella)和Pleionea三个属.在康氏菌属高度精简的基因组中存在异常丰富的胞外蛋白酶编码基因,暗示此类海洋细菌对海洋颗粒有机物中的蛋白质成分降解具有重要贡献.鉴于已分离鉴定的康氏菌属模式菌株专一性利用蛋白类营养物质,我们建议将该属译为“食朊菌属”.本文将结合本实验室的研究进展,对康氏菌科细菌的分离培养过程、系统发育关系、代谢特点和潜在生态功能进行综述,为研究此类海洋细菌的生理生态功能提供思路.

摘要： 为在筛选用于肉制品发酵的有益葡萄球菌,通过划线分离,从发酵肉制品中筛选出54株菌,根据菌株耐盐性及16S DNA测序结果,选择8株耐盐葡萄球菌做血浆凝固酶试验。经鉴定,其中6株呈凝固酶阴性。将凝固酶阴性葡萄球菌胞外蛋白酶与肌肉蛋白孵育20 h,分析其对肌肉蛋白的降解性能。试验结果表明,6株葡萄球菌胞外蛋白酶对肌浆蛋白250 ku处的蛋白条带有一定的降解能力,然而对肌原纤维蛋白无明显降解作用。

摘要： 原料乳低温储藏期间,嗜冷菌大量繁殖,对乳制品质量和保质期构成极大威胁.特别是嗜冷菌产生的胞外蛋白酶、脂肪酶和磷脂酶等酶类能耐受巴氏杀菌和高温瞬时灭菌,水解牛奶中的蛋白质、脂肪和卵磷脂等营养物质.本文重点介绍嗜冷菌及其胞外产物对原料乳加工的影响和常见的快速分析检测方法,以期为乳品安全加工提供理论依据.

摘要： 为了给短小芽孢杆菌的改造提供新思路,提高碱性蛋白酶产量,实验室前期对短小芽孢杆菌进行了转录组测序,预测了短小芽孢杆菌的sRNA.本研究通过生物信息学方法和Northern杂交鉴定了一个新的sRNA Bpsr112.然后构建了Bpsr112的敲除型菌株和过表达菌株,利用相关菌株进行了生长曲线、盐胁迫和蛋白酶活等实验,再利用SDS-PAGE检测胞外蛋白酶AprE的表达水平.结果 表明,在发酵至60 h和72 h时,与对照菌株相比,敲除型菌株酶活显著降低(P<0.01),过表达菌株酶活显著提高(P<0.01);同时SDS-PAGE结果表明,AprE蛋白含量在敲除菌株中降低,在过表达菌株中提高,说明sRNA Bpsr112对短小芽孢杆菌蛋白酶活具有正调控.本研究鉴定了短小芽孢杆菌中的sRNA,并发现Bpsr112对蛋白酶活具有促进作用.

摘要： 从即食海参中分离到一株条件性致病菌—蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei H 4),对该菌所产胞外蛋白酶进行了初步研究.结果表明,菌株生长达到对数期时检测到最大酶活力,硫酸铵质量分数为50％时提取的胞外蛋白酶活力最大,该菌所产胞外蛋白酶的最适反应条件为45°C、pH 7.5、0.5％NaCl;Cu2+、Zn2+、Fe2+对胞外蛋白酶活力具有抑制作用,而Ca2+、Mn2+对胞外蛋白酶活力具有促进作用.丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF对胞外蛋白酶的活性具有抑制作用,说明该胞外蛋白酶主要是丝氨酸蛋白酶.红外光谱图显示蛋白酶在1663 cm-1处有吸收峰,表明其具有高级结构.

摘要： 近期,《美国科学院院报(PNAS)》在线发表了南京农业大学王源超教授团队的最新研究成果。该研究揭示了在大豆根腐病发病过程中,大豆疫霉菌通过N-糖基化修饰来保护核心毒性因子免受寄主大豆胞外蛋白酶的攻击,为实现对作物疫病的可持续控制奠定了新的理论基础。

摘要： 通过脱脂牛奶平板从分离自我国西藏芒康盐井古盐田的133 株嗜盐古菌中筛选获得11 株产胞外蛋白酶菌株,其中XZYJ18 产蛋白酶能力最强. 16S rRNA 基因序列分析表明XZYJ18 为Halorussus属的新种.XZYJ18 在对数生长后期开始大量合成胞外蛋白酶,营养丰富的培养基抑制胞外蛋白酶合成.XZYJ18 胞外蛋白酶在55 °C,pH 8.0 和0 mol/L NaCl的条件下酶活最高,在酸性、碱性、低盐或高盐条件下均具有良好的稳定性,因而能够在不同的环境中催化蛋白质水解.

摘要： 从分离自内蒙古柴达敏盐湖的嗜盐古菌中筛选高产胞外蛋白酶菌株,并对所产蛋白酶的酶学性质进行初步研究.结果表明,2株高产胞外蛋白酶嗜盐古菌CDM10和CDM12为新的分类单元.CDM10胞外蛋白酶最适反应条件为70 ～ 75°C,pH 8.0 ～9.0和1.5 mol/L NaCl.CDM12胞外蛋白酶最适反应条件为60 ～ 75°C,pH7.0 ～9.0和1.5 ～2.5 moL/L NaCl.它们具有良好的热稳定性和盐度容忍性.抑制剂实验表明CDM10和CDM12的胞外蛋白酶是丝氨酸蛋白酶,半胱氨酸和金属离子对于蛋白酶活性的发挥具有重要的作用.%Haloarchaeal strains isolated from Chaidamin Salt Lake,Inner Mongolia were screened for high protease activity.Their enzyme properties were studied.The results showed that CDM10 and CDM12 displayed the highest protease activity,and represented novel taxa.The optimal protease activity of CDM10 occurred at 70-75 °C,pH 8.0-9.0,and 1.5 mol/L NaCl.The CDM12 protease exhibited maximal activity at 60-75 °C,pH 7.0-9.0,and 1.5-2.5 mol/L NaCl.The CDM10 and CDM12 proteases were highly stable over wide ranges of temperatures and NaCl concentrations.The inhibitor experiment suggested that the CDM10 and CDM12 proteases belonged to serine protease family,and the cysteine residues and metal ions were important for the enzyme activities.

摘要： 短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)BA06菌株不仅能够产生具有皮革脱毛功能的碱性蛋白酶(DHAP),而且还可以产生多种胞外蛋白酶.基因组的分析也证实编码这些蛋白酶基因的存在,同时也存在可能的调控基因.因此,分析研究了BA06菌株外泌蛋白酶及其调控蛋白基因在盐胁迫下的转录响应.随着培养基中NaCl浓度的提高(最高0.8 M),虽然细胞在基本培养液中生长差异不大,但胞外蛋白酶的总活性显著降低,并且延后.在此基础上,利用绝对定量PCR技术分析了5个可能的外泌蛋白酶基因和4个可能的调控基因在0.8MNaC1胁迫下,连续3天的转录情况。

摘要： 胞外蛋白酶（ECPase）是哈维氏弧菌GYC1108-1胞外产物的主要致病因子，经鉴定其为半胱胺酸蛋白酶，分子量约55KD，能够分解脱脂奶中的酪蛋白，命名为1108-ECPase。本实验建立了胞外蛋白酶活性平板法检测1108-ECPase和YZ-ECPase的相对酶活（YZ为能够分泌目的蛋白酶的重组菌），并利用这个方法确定了细菌分泌ECPase达最高峰的培养时间为36h，粗提ECPase最适的饱和硫酸铵浓度为70%。 GYC1108-1和YZ培养上清经硫酸铵盐析，SephadexG-25凝胶过柱后，得到较为纯化的1108-ECPase和YZ-ECPase。选择白油、蜂胶和弗氏三种不同佐剂与适量抗原混匀，分别免疫3只ICR小鼠，并设不加佐剂免疫组及空白组作为对照。三次免疫后制备小鼠血清，间接ELISA测定抗体效价，除空白对照外，其它8组小鼠的免疫血清效价达1:1.6×104～1:2.56×105，免疫组的效价从高到低依次为弗氏＞白油＞蜂胶＞不加佐剂，不同佐剂的免疫效果依次为：弗氏＞白油＞蜂胶。免疫印迹实验结果表明：小鼠血清在55KD处有明显的反应条带。以上结果表明，ECP具有很好的免疫原性，这为下一步研究基因工程疫苗奠定了基础。

摘要： 近年来研究发现弧菌属其他细菌的胞外蛋白酶在激活肠毒素、提高血管渗透性和肠液累积、侵袭作用以及对亚铁血红素的摄取和皮肤损伤等毒性效应中发挥了重要作用，副溶血弧菌胞外蛋白酶是否存在类似的致病作用目前仍缺少系统研究。本研究拟通过Tn5转座子介导构建副溶血弧菌胞外蛋白酶缺陷体，并研究其胞外蛋白的细胞毒性效应，为深入研究副溶血弧菌胞外蛋白酶的相关分子生物学特征及致病作用机制提供材料和基础数据。

摘要： 本文以大菱鲆分离的荧光假单胞菌作为研究对象,紫色杆菌CVO26平行划线法检测信号分子.不同碳源(葡萄糖、蔗糖、果糖、木糖、乳糖、麦芽糖)的AB培养基培养并检测其生物被膜、嗜铁素和胞外蛋白酶的产生量,同时添加外源的信号分子标准品,研究AHLs与腐败因子之间的相关性.研究表明:大菱鲆分离的荧光假单胞菌能够发生群体感应现象,经不同碳源培养,其腐败因子产生情况有明显差异,碳源的添加对生物被膜的产生有促进作用,对胞外蛋白酶的产生没有显著影响;以葡萄糖、麦芽糖为碳源,生物被膜的产生量较高;以蔗糖和乳糖为碳源,嗜铁素的产量较高.添加外源信号分子标准品,生物被膜、嗜铁素和胞外蛋白酶的产生量有显著提高.因此,生物被膜、嗜铁素和胞外蛋白酶的产生与AHLs有关,群体感应现象可调控腐败特性的表达,并在水产品腐败过程中发挥作用.

摘要： 本发明公开了一种蛋白酶谱电泳检测方法在快速鉴定蛋白酶种类上的应用，包括以下步骤：a.制备不含蛋白酶底物的SDS聚丙烯酸胺凝胶；b.蛋白酶样品与不含β‑巯基乙醇的加样缓冲液混匀后加样，且加样时样品不在沸水浴中加热；c.电泳；d.洗胶；e.将胶在含有不同蛋白酶抑制剂的底物溶液中浸泡；f.反应显色。本发明方法能对不同蛋白酶进行定性，比传统方法在耗时上明显缩短；省去了分离纯化蛋白酶的繁琐步骤；重复性好，灵敏度高，活性条带测定准确，非常有利于后续的蛋白酶鉴定及有目的的纯化工作；可以用于各种蛋白酶类型的检测，有广阔的应用空间。

摘要： 本发明公开了一种蛋白酶谱电泳检测方法在快速鉴定蛋白酶种类上的应用，包括以下步骤：a.制备不含蛋白酶底物的SDS聚丙烯酸胺凝胶；b.蛋白酶样品与不含β-巯基乙醇的加样缓冲液混匀后加样，且加样时样品不在沸水浴中加热；c.电泳；d.洗胶；e.将胶在含有不同蛋白酶抑制剂的底物溶液中浸泡；f.反应显色。本发明方法能对不同蛋白酶进行定性，比传统方法在耗时上明显缩短；省去了分离纯化蛋白酶的繁琐步骤；重复性好，灵敏度高，活性条带测定准确，非常有利于后续的蛋白酶鉴定及有目的的纯化工作；可以用于各种蛋白酶类型的检测，有广阔的应用空间。

摘要： 本发明公开了一种耐冷假单胞菌胞外蛋白酶失活方法，包括以下步骤：将含有耐冷假单胞菌胞外蛋白酶的溶液在50‑70°C热浴加热2‑4min，再经800W微波加热60‑120s。上述的胞外蛋白酶失活方法，与低温失活方法相比，大大缩短了处理时间，降低能耗，灭活效果也优于传统方法，并且，不会破坏胞外蛋白酶所处的溶液环境中的其他营养物质。

摘要： 本发明提供了一种检测胞外蛋白酶酪蛋白水解活性及耐热性的方法。该方法包括：(1)将微生物培养液离心、取上清液；(2)将一部分上清液加热；(3)将经过与未经过热处理的上清液与反应缓冲液混合，35‑45°C反应2‑3小时，终止反应，离心，取上清转移至多孔板，加入强碱溶液，检测450nm吸光值；(4)将450nm吸光值换算为胞外蛋白酶酪蛋白水解活性；胞外蛋白酶的耐热性为经过热处理与未经过热处理的上清液中的胞外蛋白酶酪蛋白水解活性的比值。本发明方法可以同时对微生物胞外蛋白酶酪蛋白水解活性及耐热性进行定量测试，更加精确比较菌株之间的差异，使操作更便捷，节省了培养基，能够实现批量操作并可直接检测菌液上清。

摘要： 本发明属于生物技术领域，涉及一种重组质粒及其制备的嗜水气单胞菌胞外蛋白酶重组蛋白亚单位疫苗。重组质粒pET32a-epr2-3，该重组质粒以pET32a为出发质粒，其Kpn I和EcoRI酶切位点之间插入嗜水气单胞菌的epr3基因，EcoR I and Sal I酶切位点间插入嗜水气单胞菌的epr2基因。所述的嗜水气单胞菌胞外蛋白酶重组蛋白亚单位疫苗包含将转染重组质粒pET32a-epr2-3的大肠杆菌进行诱导表达所获得的重组蛋白epr2-3与佐剂。实验证明该亚单位疫苗具有较高的安全性，生产工艺简单，保存和运输条件要求不高，并且能够刺激机体全方面的免疫应答，具有广泛的开发和应用前景。

摘要： 本发明公开了一种促进乳源假单胞菌分泌胞外蛋白酶的方法，所述方法包括如下步骤：步骤一、将乳源添加剂加入到培养基中进行均质处理，然后灭菌；步骤二、将具有分泌蛋白酶AprX的乳源嗜冷假单胞菌按照0.5～1.5％(v/v)的接种量接种到培养基中活化2～4次，将活化好的乳源嗜冷假单胞菌接种到添加乳源添加剂的培养基中进行培养。该方法通过添加0.5～5％(w/v)的乳源添加剂能够使得假单胞菌分泌的蛋白酶活力提高3～5倍。

摘要： 本发明公开了一种耐冷假单胞菌胞外蛋白酶失活方法，包括以下步骤：将含有耐冷假单胞菌胞外蛋白酶的溶液在50‑70°C热浴加热2‑4min，再经800W微波加热60‑120s。上述的胞外蛋白酶失活方法，与低温失活方法相比，大大缩短了处理时间，降低能耗，灭活效果也优于传统方法，并且，不会破坏胞外蛋白酶所处的溶液环境中的其他营养物质。

摘要： 本发明提供了一种检测胞外蛋白酶酪蛋白水解活性及耐热性的方法。该方法包括：(1)将微生物培养液离心、取上清液；(2)将一部分上清液加热；(3)将经过与未经过热处理的上清液与反应缓冲液混合，35-45°C反应2-3小时，终止反应，离心，取上清转移至多孔板，加入强碱溶液，检测450nm吸光值；(4)将450nm吸光值换算为胞外蛋白酶酪蛋白水解活性；胞外蛋白酶的耐热性为经过热处理与未经过热处理的上清液中的胞外蛋白酶酪蛋白水解活性的比值。本发明方法可以同时对微生物胞外蛋白酶酪蛋白水解活性及耐热性进行定量测试，更加精确比较菌株之间的差异，使操作更便捷，节省了培养基，能够实现批量操作并可直接检测菌液上清。

摘要： 本实用新型公开了一种耐冷假单胞菌胞外蛋白酶失活装置，包括恒温加热机构(1)、微波加热机构(2)和管道(3)；管道依次贯穿通过恒温加热机构和微波加热机构，管道包括主管道(31)、设于恒温加热机构内的第一支路(32)和第二支路(33)，第一支路和第二支路分别通过选择阀(4)与主管道连通，并且第一支路与第二支路的管程不相等；微波加热机构内的主管道为耐微波加热管道，并设有流量调节阀(5)。上述的失活装置通过设置主管道、第一支路和第二支路，将耐冷假单胞菌胞外蛋白酶的失活步骤串联起来，同时，通过两个不同管程的支路，以及流量调节阀，实现了对恒温加热时间以及微波加热时间的双重调控，进而使失活方法能够方便地连续进行。

摘要： 本实用新型提供一种检测胞外蛋白酶酪蛋白水解活性及耐热性的试剂盒。其包括：盒盖、盒体、衬垫、装有偶氮酪蛋白溶液的容器、装有三氯乙酸溶液的容器、装有氢氧化钠溶液的容器和酶标板，衬垫设置于所述盒体内，衬垫上设有容器孔和槽，装有偶氮酪蛋白溶液的容器和三氯乙酸溶液的容器置于容器孔内，酶标板置于槽内。本实用新型试剂盒1)可以同时对微生物胞外蛋白酶酪蛋白水解活性及耐热性进行定量测试，更加精确比较菌株之间的差异；2)使得操作更加便捷；3)节省了培养基的使用；4)通过酶标板的使用能够实现批量操作；5)可以直接检测菌液上清，比较一定体积单位中胞外蛋白酶酪蛋白水解活性及耐热性。