胚胎成纤维细胞

摘要： 目的 探究肾母细胞瘤过表达因子(NOV/CCN3)对间充质干细胞增殖的影响及调控机制,为CCN3能否作为促增殖因子在骨组织工程的应用提供理论依据.方法 以小鼠成纤维细胞(MEFs)为间充质干细胞模型,利用重组腺病毒Ad-CCN3和Ad-siCCN3分别上调、下调MEFs中CCN3表达;流式细胞术检测不同处理组细胞周期、凋亡变化情况;Westernblot检测增殖指标PCNA、周期蛋白cyclin E、cyclin B1以及凋亡指标Bax、Bc1-2蛋白表达量,明确CCN3对MEFs增殖和凋亡的影响;ELISA检测CCN3蛋白分泌水平;RT-qPCR和Western blot检测Notch信号通路经典受体Notch1、配体DLL1、下游关键蛋白和/基因Hey1、p300、H3K9,以及MAPK通路相关蛋白ERK1+2和p-ERK1+2表达变化情况.结果 流式细胞术结果显示:与对照组相比,Ad-CCN3组细胞增殖指数增加(P＜0.01),细胞凋亡百分比减少(P＜0.05);且相关增殖凋亡指标PCNA、cyclinE、Bcl-2蛋白表达增加(P＜0.05);RT-qPCR和Western blot结果显示过表达CCN3明显促进Notch信号通路中Notch1表达(P＜0.01),但抑制DLL1和Hey1、p300、H3K9等表达(P＜0.05);而MAPK通路中ERK1+2和p-ERK1+2蛋白表达增加(P＜0.01).结论 CCN3可能通过与Notch1结合,抑制经典Notch信号通路,激活MAPK通路,促进MEFs增殖、抑制细胞凋亡,从而增加MEFs细胞数量,提示CCN3具有作为间充质干细胞的促增殖因子在骨组织工程发挥作用的潜在价值.

摘要： 目的:探讨miR-107在特发性纤维化(IPF)中对成纤维细胞(NIH-3T3)转分化的作用.方法:培养NIH-3T3细胞,2μg/L的TGF-β诱导NIH-3T3细胞转分化.收集培养48 h的细胞,Western blot法检测对照组和TGF-β组NIH-3T3细胞转分化标志α-SMA、CollagenⅠ、Fibronectin蛋白水平.将miR-107模拟物(mimic)及抑制剂(inhib-itor)分别转染NIH-3T3细胞,分为对照组、TGF-β组、TGF-β+NC组、TGF-β+inhibitor组、TGF-β+mimic组.West-ern blot检测NIH-3T3细胞 α-SMA、CollagenⅠ、Fibronectin蛋白水平的表达.结果:与对照组相比,TGF-β 组 α-SMA、CollagenⅠ、Fibronectin蛋白表达水平升高,miR-107的相对表达水平升高(P<0.05).转染miR-107 inhibitor后,与TGF-β+NC组相比,miR-107 inhibitor组细胞中miR-107表达水平降低(P<0.05);与TGF-β+NC组相比,TGF-β+inhibitor组的α-SMA、CollagenⅠ、Fibronectin蛋白水平均降低(P<0.05).转染miR-107 mimic后,与TGF-β+NC组相比,miR-107 mimic组细胞中miR-107表达水平升高(P<0.05);TGF-β+mimic组的α-SMA、CollagenⅠ、Fibronectin蛋白水平均升高,差异有统计学意义(P<0.05).结论:抑制miR-107的表达可以抑制TGF-β诱导的NIH-3T3细胞转分化.

摘要： Objective:To establish an immortalized mouse embryonic fibroblast (MEF) cell line of PLEKHQ1 gene knockout mice in order to comprehensively research function of PLEKHQ1 gene and provide cell experiment materials.Methods: The method of slow virus infection was adopted to transfect gene of simian virus 40(SV40)large T antigen into MEF cell which have been identified genotype to establish an immortalized cell lines. Polymerase chain reaction(PCR)was used to detect the integration of the genome of SV40 large T antigen in the mice embryonic fibroblast cell. Expression of SV40 large T antigen gene in MEF cell was identified by reverse transcription PCR and gel imaging.Results: The mRNA of SV40 T antigen gene has been integrated in cells of the immortalized cell line, and through observation, stable growth and serial propagation of the immortalized MEF cell have achieved for half the year.Conclusion: Successful establishment of the PLEKHQ1 knockout immortalized MEF cell line can provide cell experimental material for further study of PLEKHQ1 function.%目的:建立PLEKHQ1基因敲除小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)永生化细胞系,为全面研究PLEKHQ1基因功能提供细胞实验材料.方法:采用慢病毒感染的方法将猿猴病毒40(SV40)大T抗原基因导入已鉴定出基因型的MEF中,建立永生化细胞系;利用聚合酶链反应(PCR)检测SV40大T抗原基因在MEF中的整合情况,利用反转录PCR及凝胶成像的方法观察SV40大T抗原基因在MEF中的表达.结果:SV40大T抗原基因已整合至MEF中,且此类MEF已扩大培养及稳定传代半年之久.结论:成功建立的PLEKHQ1基因敲除MEF永生化细胞系,可为进一步研究PLEKHQ1基因功能提供细胞实验材料.

摘要： Objective To explore the role of p38 MAPK on the apoptosis of mouse embryo fibroblasts induced by myeloid-related protein 8 (MRP8)/myeloid-related protein 14 (MRP14).Methods MTT assay was performed to detect the cell viability of p38+/+ and p38-/-cells in the control group and groups in which cells were treated with 50 μg/mL MRP8, MRP14, and MRP8/14 for 24 h and 48 h;flow cytometry was applied to detect the apoptosis rate of p38+/+ and p38-/-cells in the control group and groups in which cells were treated with 50 μg/mL MRP8/14 for 24 h and 48 h;MTT assay was performed to detect the cell viability of p38+/+ cells in the control group, MRP8/14 group, MRP8/14+TAK242(TLR4 inhibitor) group and MRP8/14+RAGE neutralized antibody group for 24 h;MTT and flow cytometry were used to analyze the cell viability and the apoptosis rate of p38+/+ cells in the control group, MRP8/14 group, MRP8/14+SB203580 (p38 MAPK inhibitor) group for 24 h;Western blotting was used to detect the phosphorylation changes of p38 MAPK in p38+/+ cells treated with MRP8/14 for 0, 1, 2, 4, 6, and 8 h, respectively.Results The cell viability of p38+/+ and p38-/-cells in the groups treated with MRP8, MRP14, and MRP8/14 for 24 h and 48 h was lower than that of the control group (P0.05).MRP8/14组、MRP8/14+RAGE组干预24 h p38+/+细胞活力低于空白对照组、MRP8/14+TAK242组干预24 h(P均<0.05).MRP8/14+SB203580组干预24 h p38+/+细胞活力较MRP8/14组干预24 h明显升高,细胞凋亡率较MRP8/14组干预24 h明显降低(P均<0.05).MRP8/14干预2、4、6 h p38+/+细胞p38 MAPK磷酸化水平明显高于干预0、1、8 h(P均<0.05).结论 p38 MAPK能促进MRP8/14诱导的小鼠成纤维细胞凋亡,其机制可能与TLR4-p38 MAPK信号通路激活有关.

摘要： 小鼠Reticulocalbin（RCN3）蛋白是一种定位于哺乳动物内质网分泌途径,含有6个EF-Hand结构域的内质网钙离子结合蛋白。为了研究Rcn3与内质网应激机制的相关性,我们利用前期获得的Rcn3基因敲除小鼠胚胎成纤维细胞作为实验材料。将细胞分别用毒胡萝卜素（TG）和衣霉素（TM）处理,并通过QPCR和Western Blot技术测得在内质网应激情况下Rcn3基因和RCN3蛋白的表达量。

摘要： 目的 观察鼠胚胎成纤维细胞三维培养修复大鼠全层皮肤缺损的效果,并对其机制进行分析.方法 采用组织块法培养鼠胚胎成纤维细胞,将鼠尾胶原溶液和以血清重悬的鼠胚胎成纤维细胞溶液混合后形成凝胶构建组织工程皮肤,移植于大鼠背部全层皮肤缺损创面.实验组30只全层皮肤缺损大鼠采用组织工程皮肤进行修复.对照组30只全层皮肤缺损大鼠不做任何处理.两组创面分别进行HE染色和免疫组织化学染色,计算微血管密度,观察其愈合过程.结果 术后20 d实验组用组织工程皮肤覆盖的大鼠背部创面已完全愈合,新生上皮外观与结构和正常皮肤相似;对照组创面仍有痂皮覆盖,去除痂皮可见肉芽组织红润致密,创面周围新生上皮呈粉红色,边缘锐利皱缩.实验组创面组织中CD31表达及微血管密度均明显高于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 鼠胚胎成纤维细胞三维培养对动物皮肤全层缺损的修复有很好的效果,在修复皮肤损伤方面具有良好的临床应用前景.

摘要： 本研究旨在探索西藏藏猪生长迟缓成因和分子机理.采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术对西藏藏猪生长激素受体(GHR)基因克隆,采用生物信息学方法分析西藏藏猪生长激素受体基因与其他常见品种猪基因与蛋白序列差异,并构建GHR基因的真核过表达质粒,转染到西藏藏猪胚胎成纤维细胞(PEFs)上进行瞬时表达,通过MTT检测细胞增殖活性,利用实时荧光定量PCR技术检测细胞的胰岛素样生长因子-1(IGF-1)表达的情况.西藏藏猪GHR基因编码区1 716 bp,编码572个氨基酸;与普通猪GHR基因序列进行比对分析表明,在西藏藏猪GHR基因编码区1 225 bp处发生T→G突变,导致丝氨酸突变为丙氨酸;GHR基因真核过表达质粒成功转染PEFs后,PEFs生长活性显著提高;qPCR 检测表明,细胞株中IGF-1表达显著上调.综上表明,GHR基因的表达可以提高PEFs细胞的增殖活性,诱导IGF-1基因的表达,GHR基因在1 225 bp处的点突变可能影响西藏藏猪的生长迟缓.

摘要： To investigate the effects of catalytic subunit βof protein phosphatase 2A (PP2A)on cell cycle and cell apoptosis in mouse embryo fibroblasts (MEFs),the mouse embryos at E12.5 by mating the heter-ozygotes of Cβ subunit conventional knockout male and female mice at the ratio of 1 ∶ 2 were obtained. MEFs were prepared by trypsin digestion and genotyped by PCR,RT-PCR and Western blot to identify the genetic basis of each embryo.FACs was carried out to determine the cell apoptosis and cell cycle, meanwhile,the anti-apoptosis protein Bcl-2 was checked by Western blot.Genotyping by PCR,RT-PCR and Western blot showed that both knockout and wildtype MEFs were isolated by trypsin digestion at the ratio of 3∶3.The MEFs at M1 stage was 46.94%±4.17 and 53.95%±2.81,respectively and M2 stage was 29.83%±3.25 and 21.14%±2.53.There is no significant difference in cell apoptosis between wildtype and Cβknockout MEFs and slight significant difference between wildtype and knockout MEFs in cell cycle.%为探究蛋白磷酸酶2A 的 Cβ亚基在胚胎成纤维细胞(MEFs)凋亡过程中的作用,用 Cβ＋/－的杂合子雄鼠与雌鼠1∶2配对,取胚胎期12．5 d(E12．5)的胚胎制备 MEFs,用 PCR、RT-PCR 和 Western blot方法进行基因型鉴定。同时对 P3代 MEFs 利用流式分选技术检测其细胞凋亡和细胞周期的变化,并采用Western blot 检测抗凋亡蛋白 Bcl-2的表达。结果采用胰酶消化方法成功获得了 MEFs,DNA、RNA 和蛋白水平鉴定显示获得了3对3的野生型和 Cβ基因敲除 MEFs。流式分选发现 Cβ基因敲除 MEFs 和野生型之间细胞分裂期前期(M1期)细胞分别为53．95％±2．81和46．94％±4．17,细胞分裂期后期(M2期)细胞分别为21．14％±2．53和29．83％±3．25。但 Bcl-2的蛋白表达量和 mRNA 表达量没有显著差异。结果表明,虽然蛋白磷酸酶2A 的 Cβ亚基的缺失并不会导致小鼠胚胎死亡,但 Cβ亚基的缺失会轻微影响胚胎成纤维细胞(MEFs)的细胞周期。

摘要： [Objective] Transposons are the basic unit of chromosomes which can autonomously replicate and shift within the whole genome. Sleeping beauty(SB), piggyBac(PB) and Tol2, found from salmonid, cabbage looper mothTrichoplusia ni and Oryzias latipes, respectively, are most active transposons in the vertebrates today. This paper compares the transfection, insertion and cutting efficiencies of the 3 different transposons in 3T3 cells, then obtained the best transposon system at the cellular level.[Method] The 3′ and 5′ terminal transposable elements were cloned from SB, PB and Tol2 transposon vectors using the high-fidelity PCR in this experiment, ensured the accuracy through sequencing, then the transposable elements were subcloned one-by-one into the pT2-HB carrier frame, thus constructed the multi-transposon vectors, pT3-PST, which included all 3 transposons. Green fluorescent protein expression cassette (pCAG-GFP) and neomycin expression cassette (NEO) genes were cloned into pT3-PST carrier, resulting in two expression vectors, pT3-PST-CAG-GFP and pT3-PGK-NEO. These two expression vectors, with the transposase expression plasmid pCMV-SB100X,were mixed with pCMV-HAhyPBase and pCMV-Tol2 at a mass ratio of 1:1, respectively. They were then wrapped by polycation PEI, and co-transfected into the mouse embrynic fibrilasts (3T3). At the same time, a negative control group was set up using the inactive transposase vector SB△DD. After 36 h post-transfection ofGFP, detection ofGFP expression was done by fluorescence microscopy, and real-time fluorescent quantitative PCR, after cell genome extraction and usingAmp as an internal reference. Primers were designed according to the upstream and downstream sequences, then the cutting efficiency of the 3 transposons was determined by real-time fluorescent quantitative PCR. After 48 h post-transfection of NEO, cells were filtered by using 500 µg·mL-1 G418 resistance screening until the normal cells were almost dead (10 d). The cells were stained with Giemsa stain, and the number of drug-resistant cells was counted, and finally different transposon activities of different groups were compared.[Result]Multi-transposon vectors, PT3-PST, pT3-PST-CAG-GFP,and pT3-PGK-NEO were successfully constructed. The transfection efficiency of cells in the experimental groups was more than 50%, and the difference was not significant (P>0.05). TheGFP relative copy number of SB group was higher than Tol2 and PB groups, but the difference was not significant (P>0.05), though it was significantly higher than the control group (P0.05). pT3-PGK-NEO and transposase co-transfected 3T3 cells, and the results of G418 selection showed that the number of drug-resistant cells of SB group was significantly higher than PB and Tol2 groups (P0.05). However, all the three experiment groups were significantly higher than that of the control group (P<0.01).[Conclusion]The SB transposon system efficiency, at the cellular level, was better than PB and Tol2, which could provide an effective tool for cellular transgenetic research.%【目的】转座子（transposon, Tn）是染色体上可自主复制和移位的基本单位，普遍存在生物体基因组内，Sleeping beauty（SB）、piggyBac（PB）和Tol2分别来源于鲑鱼、甘蓝尺蠖蛾和青鳉鱼，是目前脊椎动物中活性较高的转座子。比较了这3种转座子在哺乳动物细胞的转染、插入和剪切效率，从而获得细胞水平上的高活性转座子系统。【方法】通过高保真PCR法分别从SB、PB和Tol23种转座子载体克隆3种转座子3′和5′端的转座元件，测序正确后，将各转座元件依次亚克隆至 pT2-HB 载体框架，构建成包含这3种转座子的多转座子载体pT3-PST。将绿色荧光蛋白表达框CAG-GFP和新霉素表达框PGK-NEO分别克隆至pT3-PST载体，获得两个表达载体pT3-PST-CAG-GFP和pT3-PGK-NEO。将这两个表达载体分别和转座酶表达质粒pCMV-SB100X、 pCMV-HAhyPBase、pCMV-Tol2以1﹕1质量比混合，经多聚阳离子PEI包裹，共转染小鼠胚胎成纤维细胞（3T3），同时以突变失活的转座酶质粒SB△DD与转座子载体共转染作为阴性对照组。转染GFP 36 h后，用荧光显微镜进行检测GFP表达率，提取细胞基因组，以Amp基因作为内参，进行实时荧光定量PCR，检测GFP插入拷贝数；根据被剪切位置上下游序列设计引物，进行实时荧光定量PCR，检测3种转座子的剪切效率。细胞转染NEO 48 h后，用浓度为500µg·mL-1的G418进行耐药性筛选，至正常细胞基本全部死亡（10 d），将细胞进行吉姆萨染液染色，统计耐药细胞数，从而比较各组转座活性。【结果】成功构建了多转座子载体 PT3-PST、pT3-PST-CAG-GFP和pT3-PGK-NEO。实验组转染细胞效率均大于50%，且差异不显著（P＞0.05）。SB组GFP相对拷贝数高于Tol2和PB组，但差异不显著（P＞0.05），均显著高于对照组（P＜0.05）。SB和PB组剪切效率显著高于Tol2组（P＜0.05），但SB和PB组之间差异不显著（P＞0.05）。pT3-PGK-NEO与转座酶共转染3T3细胞，G418抗性筛选结果表明，SB组耐药细胞数显著高于PB和Tol2组（P＜0.05），但PB和Tol2两组差异不显著（P＞0.05），此3组均极显著高于阴性对照组（P＜0.01）。【结论】SB转座子系统在细胞水平的转座效率优于PB和Tol2，为细胞水平的转基因研究提供有效基因转移工具。

摘要： Objective To investigate the effect of CCM3 gene defection on lead induced cell genotoxicity in mouse embryonic fibroblasts.Methods C57 female mice were mated with CCM3 gene heterozygous male mice.E13.5 embryos were taken to isolate primary mouse embryonic fibroblasts.After genotyping,wild type and heterozygous cells were treated with different doses of lead acetate.Cell viability,genotoxicity and protein expression were detected by MTS assay,CB micronucleus method and Western blot,respectively.Results Mouse embryonic fibroblasts with lead acetate treatment for 24 h,wild-type cells 100.00 μmol/L lead acetate-treated group (69.16 ± 1.36) and the control group (100.00 ± 2.33) compared to cells decreased by 30％,CCM3 heterozygous type cell 100.00 μmol/L lead acetate-treated group (87.16±5.50) and the control group (100.00 ± 2.06) compared to cells decreased by 13％,the difference was statistically significant (F values were 98.59,82.63,P ＜ 0.001).Lead acetate treatment after 48 h,wild-type cells 100.00 μmol/L lead acetate-treated group (51.99 ±5.62) and the control group (100.00 ± 3.11) compared to cells decreased by 50％,heterozygous type cells 100.00 μmol/L lead acetate treatment group (66.33 ± 4.06) and the control group (100.00 ± 5.72) compared to cells decreased by 35％,the differences were statistically significant (F values were 82.63,36.86,P ＜0.001).The results of CBMN test showed that with increased dose,micronucleus cell rate of two genotypes showed an increasing trend,in the wild-type cells,the micronucleus cell rate (/1 000) for the control group,29.6 ± 2.2,6.25 μmol/L dose group 47.3 ± 6.6,25 μmol/L dose group 55.5 ± 9.1,100.00 μ mol/L dose group 66.8 ±3.5;heterozygous cells micronucleus cell rate (/1 000) for the control group,35.3 ± 5.6,6.25 μmol/L dose of 50.0 ± 8.3,25.00 μ mol/L dose group 57.0 ± 8.5,100.00 μmol/L dose group 58.8 ±2.1.Micronucleus cell rates(/1 000) were significant differences,in 100.00 μmol/L dose groups of two genotypes.Western blot results showed that wild-type cells CCM3 expression 100.00 μmol/L lead acetate-treated group (0.70 ± 0.03) was 1.32 times higher than the control group (0.53 ± 0.07),heterozygous cells CCM3 expression 100.00 μmol/L lead acetate-treated group (0.48 ± 0.02) was 1.77 times higher than control group that of 0.27 ± 0.04,there was statistically significant difference (F values were 14.77,25.74,P ＜ 0.001);wild-type cells γ-H2AX expression 100.00 μmol/L lead acetate-treated group (0.69 ± 0.03) was 1.06 times higher than the control group (0.65 ± 0.07),heterozygous cells γ-H2AX expression 100.00 μmol/L lead acetate-treated group (0.99 ±0.04) was 1.55 times higher than the control group CCM3 expression levels (0.64 ± 0.06),there was statistically significant difference (wild-type cells:F =7.08,P =0.012,heterozygous type cell:F =13.49,P =0.002).Conclusion CCM3 gene may play a role in lead-induced genetic toxicity of mouse embryonic fibroblasts,CCM3 gene-lead interactions effects on mouse embryonic fibroblasts cell toxicity.%目的 探讨CCM3基因缺陷对醋酸铅所致小鼠胚胎成纤维细胞遗传毒性的影响.方法 将C57雌鼠与CCM3基因敲除小鼠杂合雄鼠合笼后,取孕13.5 d的胎鼠,原代分离培养胚胎成纤维细胞.基因分型后,野生型和CCM3基因缺陷型细胞分别给予6.25、12.50、25.00、50.00、100.00、200.00 μmol/L醋酸铅处理,用MTS法检测细胞活性,并根据实验结果,选择6.25、25.00、100.00 μmol/L醋酸铅染毒,用双核阻滞法检测遗传毒性,用Western blot法检测相关基因的蛋白表达情况.结果 小鼠胚胎成纤维细胞经醋酸铅处理24 h后,野生型细胞100.00 μmol/L醋酸铅处理组(69.16±1.36)与对照组(100.00±2.33)相比,细胞活性下降了30％,杂合型细胞100.00 μmol/L醋酸铅处理组(87.16±5.50)与对照组(100±2.06)相比,细胞活性下降了13％,差异有统计学意义(F野生型=98.59,F杂合型=82.63,P值均＜0.001).经醋酸铅处理48 h后,野生型细胞100.00 μmol/L醋酸铅处理组(51.99±5.62)与对照组(100.00±3.11)相比,细胞活性下降了50％,杂合型细胞100.00 μmol/L醋酸铅处理组(66.33±4.06)与对照组(100.00±5.72)相比,细胞活性下降了35％,差异均有统计学意义(F野生型=82.63,F杂合型=36.86,P值均＜0.001).双核微核实验结果显示,随着染毒剂量增加,两种基因型细胞的核分裂指数逐渐下降,双核细胞微核率呈逐渐升高趋势,野生型细胞对照组、6.25、25.00、100.00 μmol/L剂量组的双核微核细胞率分别为29.6 ±2.2、47.3±6.6、55.5±9.1、66.8±3.5(/1 000);杂合型细胞的双核微核细胞率则分别为35.3 ±5.6、50.0±8.3、57.0±8.5、58.8±2.1(/1000).Western blot结果显示,野生型细胞100.00 μmol/L醋酸铅处理组(0.70±0.03)的CCM3表达量是对照组(0.53±0.07)的1.32倍,杂合型细胞100.00 μmol/L醋酸铅处理组(0.48±0.02)的CCM3表达量是对照组(0.27±0.04)的1.77倍,缺陷型细胞升高较多,差异有统计学意义(F野生型=14.77,F杂合型=25.74,P值均＜0.001);野生型细胞100.00 μmol/L醋酸铅处理组(0.69±0.03)的γ-H2AX表达量是对照组(0.65±0.07)的1.06倍,杂合型细胞100.00 μmol/L醋酸铅处理组(0.99±0.04)的CCM3表达量是对照组(0.64±0.06)的1.55倍,差异有统计学意义(F野生型=7.08,P=0.012;F杂台型=13.49,P=0.002).结论 CCM3基因可能在铅所致小胚胎成纤维细胞的遗传毒性中发挥作用,在小鼠胚胎成纤维细胞毒性方面,铅暴露与CCM3基因存在交互作用.

摘要： 目的：克隆西藏小型猪的生长激素受体(GHR)基因的cDNA序列,构建GHR基因真核表达质粒,在胚胎成纤维细胞(PEFs)中表达. 方法：采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术对西藏小型猪的GHR基因的cDNA进行克隆,并构建了GHR-pIRES2-EGFP真核表达质粒,转染到西藏小型猪的胚胎成纤维细胞上进行瞬时表达,利用实时荧光定量PCR技术检测细胞的IGF-1表达的情况. 结果：测序结果显示：西藏小型猪GHR基因的序列片段长1934bp,包含编码区1721bp,该编码区编码了572个氨基酸,重组质粒GHR-pIRES2-EGFP经过NheⅠ与SalⅠ双酶切后,得到5308bp和1934bp的条带;真核表达质粒成功转染PEFs后,检测到IGF-1表达量上调的更高. 结论：为进一步研究GHR基因的功能及信号的转导奠定了基础.

摘要： 探索用NucleofectorⅡ核转染仪将外源基因导入西藏小型猪胚胎成纤维细胞(PEFs)的可行性.使用Lonza公司的NucleofectorⅡ核转染仪,参考已报道的转染其他猪种的PEFs效率最高的U020程序与相应的转染试剂,将绿色荧光蛋白(GFP)基因导入西藏小型猪PEFs,并与脂质体转染的方法进行对比,观察转染效率.结果显示，转染5小时后,核转染仪组镜下即可见绿色荧光,转染效率高达80％,远远高于脂质体转染的方法.结论表明，用NucleofectorⅡ核转染仪能实现西藏小型猪PEFs的高效转染,按照本文所述的转染条件,转染效率可达80％.

摘要： 本研究以Zmpste24-缺陷早衰小鼠胚胎成纤维细胞(Zmpste24/-MEFs)为研究对象,利用Co-IP、免疫荧光、western blotting和与衰老相关的B-半乳糖苷酶染色等实验技术,重点探讨Zmpste24/-MEFs中HP1与异常prelaminA结合是否导致其分布异常,以及与Zmpste24-/-MEFs中DNA损伤修复障碍的联系.研究结果显示:1.三种HP1亚型中,HP1α与异常Prelamin A有较强相互作用,并且和HP1α与lamin A的相互作用类似;2.HP1与异染色质标志物组蛋白H3K9Me3共定位分析显示,Zmpste24-/-MEFs中HP1α虽然信号强度增加,但与H3K9Me3共定位程度明显低于Zmpste24+/+ MEFs,而HP1β与HP1γ信号强度及其与H3K9Me3共定位程度在两种细胞中无明显差异;3.DNA损伤前,Zmpste24-/-MEFs中DNA损伤信号γH2AX数量较多,说明该细胞本身即存在DNA损伤;给于细胞4μM喜树碱(CPT)造成DNA损伤后,Zmpste24-/-MEFs中γH2AX信号数量变化显示DNA修复延迟,但HP1α本身信号数量和强度在两种细胞中未见明显变化;4.HP1α以Thr50位点磷酸化的形式脱离H3K9Me3并参与异染色质DNA损伤修复,HP1αT50P信号数量在Zmpste24+/+MEFs中DNA损伤后0-4小时内呈现先增多后减少的动态变化过程,与γH2AX相类似,两者共定位灶比例在DNA损伤后4小时可达到90％;而在Zmpste24-/-MEFs中,HP1αT50信号变化趋势不如对照细胞明显且延后,并伴随HP1αT50P与γH2AX共定位灶数目减少,DNA损伤后4小时只有约55％的共定位灶.5.siHP1α明显减少HP1α和HP1αT50P蛋白水平,但DNA损伤后HP1αT50P仍然明显升高.损伤后4小时HP1αT50P与γH2AX共定位灶比例提高到约77％.与衰老相关的β-半乳糖苷酶检测发现siHP1α处理的Zmpste24-/-MEFs中蓝染细胞比例由53％下降到25％,同时P16升高的基因表达也部分恢复.以上实验结果说明,异常LaminA不仅引起核膜结构异常,也影响了异染色质在核内的分布;三种亚型HP1中,HP1α蛋白水平升高且在Zmpste24-/-早老小鼠MEFs中分布异常;DNA损伤后,HP1αT50P磷酸化水平较低、信号产生和消失时间明显延后.降低早老小鼠HP1α水平后有利于松弛异染色质,提高HP1αT50P动员以及募集到DNA损伤位点的能力,促进DNA损伤修复,有利于缓解早老细胞衰老表型的出现.在由此看出,HP1α是引起早老细胞中DNA修复障碍和衰老表型出现的重要原因,也为正常衰老发生机制和抗衰老研究提供了新靶点.

摘要： 目的:探讨丙戊酸钠是否对抑制Zmpste24-/-小鼠胚胎成纤维细胞早老有积极作用.方法:孕13d的C57小鼠,分离原代胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast,MEF),在5％CO2,37°C条件下培养,隔天传代.在间隔的那天,分别用0μmol/L,25μmol/L,50μmol/L,100μmol/L丙戊酸钠处理MEF,10h/d.(1)使用细胞计数法观察丙戊酸钠对细胞增殖的影响;(2)用流式细胞仪检测对数增长期P3、P4、P5代MEF的细胞周期,进一步观察丙戊酸钠对细胞增殖的影响;(3)取P6、P7MEF做SA-β-gal分析,检测丙戊酸钠对细胞衰老的影响.结果:三个用药组与对照组的MEF增殖曲线无明显差异,用药组的P3、P4、P5代MEF和对照组的MEF的细胞周期变化差异也无统计学意义,但SA-β-gal染色P6、P7代MEF,用药组染色阳性细胞数较对照组减少,并呈现药物依赖性,统计学分析显示差异有显著性意义.结论:丙戊酸钠对胚胎成纤维细胞(MEF)的增殖周期无明显影响,但可抑制Zmpste24-/-MEF早老,相关机制正在进一步研究.

摘要： 目的：本试验应用反向转染方法针对小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast,MEF)转染siRNA,试图通过观察转染前后MEF形态变化,来判断此方法针对MEF中的MC1R基因是否可以成功转染以及转染效率如何.方法：取小鼠胚胎,培养MEF并传代；根据GeneBank中小鼠MClR基因序列,设计siRNA,并进行转染,观察转染前后MEF形态.结果：结果显示,转染siRNA 24h后siRNA/RNAi-Mate复合物开始吸附于细胞表面,到48h时转染基本完成.结论：说明针对小鼠胚胎成纤维细胞MC1R基因,应用反向转染法可以成功转染siRNA且大量吸附于细胞表面.

摘要： 目的：探索和建立西藏小型猪胚胎成纤维细胞体外分离培养及性别鉴定的技术方法。方法：取35d的西藏小型猪胚胎分离胚胎成纤维细胞,进行体外原代培养及传代培养,观察细胞成纤维细胞的形态和生长状况。根据猪Y染色体上性别决定基因SRY设计引物进行性别鉴定,同时以β珠蛋白作为内参基因,建立PCR反应体系鉴别胚胎的性别。结果：西藏小型猪胚胎成纤维体外分离后,呈贴壁生长,快速增殖。PCR性别鉴定结果表明雄性胚胎细胞可扩增出一特异性SRY基因条带,而雌性则没有。该法可快速鉴定胚胎的性别,可用于体细胞克隆动物早期性别鉴定。结论：研究结果表明利用胶原酶消化法所获得的西藏小型猪胚胎成纤维细胞可在体外稳定培养并传代,利用PCR鉴定猪胎儿性别具有简单、快速、准确的特点,可应用于克隆猪研究中体细胞系的早期性别鉴定。

摘要： 目的:DKK1基因是wnt通路的阻断因子,有研究显示,在小鼠皮肤特异性过表达DKK1基因,会导致小鼠出现无毛表型.本研究利用转基因体细胞核移植的方法制备皮肤特异性过表达DKK1基因的转基因体细胞克隆西藏小型猪,以创制无毛西藏小型猪.方法:1.构建携带西藏小型猪DKK1基因的慢病毒载体pERKDZG;2.借助慢病毒将DKK1导入西藏小型猪胚胎成纤维细胞(PEFs);3.通过体细胞核移植技术制作DKK1转基因体细胞克隆西藏小型猪.结果:成功构建携带猪DKK1基因的慢病毒载体pERKDZG,并利用该慢病毒将西藏小型猪DKK1基因导入PEFs,进而流式分选获得纯的经遗传修饰的PEFs(命名为PEF-DKK1),以其作为核供体细胞.通过体细胞核移植技术,成功获得8头克隆猪,经PCR鉴定和荧光检测,证实其中3头为DKK1转基因阳性的克隆猪.结论:通过转基因体细胞核移植技术,成功制备DKK1转基因西藏小型猪.

摘要： 目的：探讨二氧化钛颗粒(TiO2)紫外照射后羟自由基的产生及对小鼠胚胎成纤维细胞(3T3)活性的影响及氧化损伤效应.rn 方法：观察10nm-锐钛矿、25-nm锐铁矿、25-nm金红石型及200-nm锐钛矿型TiO2光催化降解亚甲蓝怍用.通过MTT实验、脂质过氧化产物MDA含量的测定观察不同浓度(15.6、31.2、62.5、125.0、250.0 μg/ml)TiO2光照前后对3T3细胞的损伤效应.rn 结果：光催化降解亚甲蓝实验结果显示,TiO2光催化降解亚甲蓝的效果与TiO2浓度、粒径大小、晶型有关;TiO2浓度越高、对亚甲蓝的氧化作用越大;相同晶型锐钛矿相比,随着粒径的减小,其对亚甲蓝的氧化怍用增大.金红石型TiO2光照前后对亚甲蓝的氧化作用较锐钛矿型弱(P<0.05).MTT实验、MDA含量检测试验结果表明,TiO2染毒的高剂量组对细胞的影响大干低剂量组(P<0.05),相同晶型锐钛矿小粒径的毒性大于粒径较大的材料(P<0.05),锐钛矿型的毒性大于金红石型(P<0.05).rn 结论：TiO2紫外照射后对3T3细胞产生的氧化损伤与其紫外照射后·OH产生有关.随着TiO2浓度的增加,产生·OH的量随之增加;相同晶型锐钛矿,随着粒径的减小,产生·OH的量随之增加;锐钛矿型TiO2产生·OH的量大干相同粒径下的金红石型.MTT和脂质过氧化实验表明,紫外照射加重了TiO2染毒后细胞活性下降,脂质过氧化水平升高;细胞的损伤程度与TiO2粒子的粒径、晶型、浓度有关.相同晶型相比,随着TiO2粒径的减小,浓度的增加,对细胞的损伤效应增强.相同粒径下,锐钛矿型的毒效应大于金红石型.

摘要： 目的：研究镍冶炼烟尘对哺乳动物细胞bcl-2和bax蛋白表达水平的影响.rn 方法：取生长对数期的NIH/3T3细胞,置于镍冶炼烟尘浓度分别为0、6.25、12.50、25.00、50.00、100.00μg/ml的培养液中培养24h,MTT法检测细胞存活率、乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒测定细胞LDH活力、Hoechst33342法观察细胞凋亡形态学改变以及western blot法检测NIH/3T3细胞bcl-2和bax蛋白表达水平.rn 结果：与对照组比较,各组细胞经镍冶炼烟尘染毒24h后,细胞存活率明显降低,细胞LDH活力明显升高,差异有统计学意义(P＜0.05).镍冶炼烟尘染毒后的细胞出现明显细胞凋亡的形态学改变,各组bcl-2蛋白灰度值分别为0.524±0.012、0.576±0.007、0.629±0.009、0.566±0.010、0.345±0.009、0.274±0.013;各组bax蛋白灰度值分别为0.661±0.030、0.581±0.003、0.663±0.006、0.673±0.015、0.705±0.010、0.776±0.022,差异有统计学意义(P＜0.05),且随着剂量的增加,抗凋亡蛋白bcl-2表达呈现先升高后降低;促凋亡蛋白bax表达呈现先降低后升高.rn 结论：镍冶炼烟尘对NIH/3T3细胞具有一定的损伤作用,且可能通过氧化损伤诱导细胞凋亡的发生.

摘要： 目的：研究镍冶炼烟尘对哺乳动物细胞bcl-2和bax蛋白表达水平的影响.rn 方法：取生长对数期的NIH/3T3细胞,置于镍冶炼烟尘浓度分别为0、6.25、12.50、25.00、50.00、100.00μg/ml的培养液中培养24h,MTT法检测细胞存活率、乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒测定细胞LDH活力、Hoechst33342法观察细胞凋亡形态学改变以及western blot法检测NIH/3T3细胞bcl-2和bax蛋白表达水平.rn 结果：与对照组比较,各组细胞经镍冶炼烟尘染毒24h后,细胞存活率明显降低,细胞LDH活力明显升高,差异有统计学意义(P＜0.05).镍冶炼烟尘染毒后的细胞出现明显细胞凋亡的形态学改变,各组bcl-2蛋白灰度值分别为0.524±0.012、0.576±0.007、0.629±0.009、0.566±0.010、0.345±0.009、0.274±0.013;各组bax蛋白灰度值分别为0.661±0.030、0.581±0.003、0.663±0.006、0.673±0.015、0.705±0.010、0.776±0.022,差异有统计学意义(P＜0.05),且随着剂量的增加,抗凋亡蛋白bcl-2表达呈现先升高后降低;促凋亡蛋白bax表达呈现先降低后升高.rn 结论：镍冶炼烟尘对NIH/3T3细胞具有一定的损伤作用,且可能通过氧化损伤诱导细胞凋亡的发生.

摘要： 一种人成纤维细胞无血清培养基，包括基础培养基和无血清培养上清浓缩液，还包括如下组分及其浓度：维生素组合物为5‑100ng/mL，葡多酚为50‑200μg/mL，重组人表皮细胞生长因子为1～50ng/mL，重组人碱性成纤维细胞生长因子为50～200ng/mL，重组人转化生长因子β1为1～50ng/mL，重组血小板衍生生长因子‑C为1～10ng/mL，重组人胰岛素样生长因子‑1浓度为1～10ng/mL，β‑巯基乙醇为50～200μM，人血白蛋白浓度为1～100μg/mL，谷胱甘肽浓度为1‑100μg/mL，黄芪多糖为1‑50μg/mL，透明质酸0.1‑5μg/mL，碳酸氢钠为1.0‑3.7g/L。利用无血清培养基替代传统含动物血清的培养基来培养人成纤维细胞，避免了动物源性成分污染以及异种蛋白引起人体免疫反应等不安全因素。

摘要： 本发明公开了一种使用电磁射线治疗各种皮肤病的方法。尤其优选窄带、多色电磁射线发射器，该发射器的主发射波长对应于被对准治疗的哺乳动物组织的峰值吸收波长。还公开了一种局部成分，用于对被对准的组织进行预处理以改变该组织的峰值吸收波长。

摘要： 本发明公开了一种使用电磁射线治疗各种皮肤病的方法。尤其优选窄带、多色电磁射线发射器，该发射器的主发射波长对应于被对准治疗的哺乳动物组织的峰值吸收波长。还公开了一种局部成分，用于对被对准的组织进行预处理以改变该组织的峰值吸收波长。

摘要： 提供以新的作用机制为指标的成纤维细胞I型胶原产生促进剂的筛选方法。通过以神经激活作为指标，能够进行成纤维细胞I型胶原产生促进剂的筛选。

摘要： 本发明涉及对成纤维细胞激活蛋白(FAP)具有特异性的能够与犬、小鼠、和人FAP交叉反应的抗体、结合多肽、和scFv。

摘要： 本发明提供了一种成纤维细胞转化培养基及其应用、成纤维细胞的制备方法，涉及生物技术的技术领域。该成纤维细胞转化培养基中含有血小板活性因子(PRP)，用于诱导脐带间充质干细胞向成纤维细胞转化，可以使脐带间充质干细胞更好的向成纤维细胞转化，缓解了现有技术中存在的外源成纤维细胞获取困难的技术问题。

摘要： 提供制备CD106阳性和/或CD90阳性成纤维细胞的方法。此外，提供G‑CSF阳性成纤维细胞群。一种制备CD106阳性和/或CD90阳性成纤维细胞的方法，所述方法包括在选自于由TNF‑α和IL‑4组成的组中的一种以上的存在下培养成纤维细胞以使CD106阳性和/或CD90阳性成纤维细胞增加的步骤。

摘要： 本发明涉及一种成纤维细胞的培养基及利用其培养成纤维细胞的方法，包括基础培养基、NH

摘要： 本发明提供了一种诱导成纤维细胞分泌抗菌肽的诱导培养基和方法、成纤维细胞及应用，涉及细胞工程领域。该诱导培养基包含基础培养基、血小板裂解液和TGF‑β信号通路抑制剂。该诱导培养基能够激活皮肤成纤维细胞的脂肪分化潜能并在脂肪分化的过程中分泌抗菌肽。使用该诱导培养基诱导成纤维细胞分泌抗菌肽，操作简单，可操控性强，缓解了现有技术中存在的缺乏一种获得能够体外分泌抗菌肽的成纤维细胞的问题。

摘要： 本发明涉及包含作为从鸟类的蛋(egg)分离的细胞的胚盘多能干细胞(pluripotent stem cells，PSCs)或神经干细胞(neural stem cell s，NSCs)、胚胎成纤维细胞(embryonic fibroblasts，FBs)条件培养基(conditioned medium)作为有效成分的用于细胞增殖、皮肤再生及皱纹改善的培养基组合物，具体地，蛋(egg)细胞条件培养基可从根本上防止使用动物血清所导致的污染，而且，不存在由于使用支撑细胞而由不同物质之间的感染物质所导致的传染可能性，从而产生包括人干细胞、皮肤细胞在内的多种细胞增殖效果，并且，产生显著的皮肤再生或皱纹改善效果，因此，可将蛋细胞条件培养基有效用作用于细胞增殖的培养基组合物以及用于皮肤再生或皱纹改善的化妆品组合物。