绿色荧光蛋白质类

摘要： 目的 对丝氨酸水解酶家族1(FSH1)蛋白在犬小孢子菌中进行亚细胞定位分析.方法 以前期构建的犬小孢子菌FSH1质粒及载体pCAMBIA-LRP-增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为模板,PCR扩增FSH1基因及EGFP基因;同时利用SnaBI/KpnI对pCAMBIA-LRP-EGFP质粒双酶切获得载体DNA,将扩增的EGFP基因克隆至酶切好的载体DNA中获得EGFP表达载体;将扩增的FSH1基因及EGFP基因克隆至酶切好的载体DNA中获得融合载体Ptrcp-FSH1-EGFP-Ttrcp.通过根癌农杆菌介导的遗传转化方法,用重组质粒转化犬小孢子菌,使融合基因FSH1-EGFP在真菌通用启动子(Ptrpc)和终止子(Ttrpc)调控下在犬小孢子菌中整合型表达,利用激光共聚焦显微镜观察融合蛋白的细胞定位.结果 成功构建根癌农杆菌转化系统及犬小孢子菌EGFP表达载体;融合基因FSH1-EGFP在犬小孢子菌中获得整合型表达.激光共聚焦显微镜显示FSH1-EGFP融合蛋白的荧光信号呈颗粒状或团块状集中于犬小孢子菌的细胞质及细胞核中.结论 FSH1-EGFP融合蛋白成功定位于犬小孢子菌的细胞质及细胞核中,为进一步明确犬小孢子菌FSH1基因的功能及致病机制奠定了基础.

摘要： 目的 构建人E1A激活基因阻遏子基因(hCREG)不同截短片段的启动子增强型绿色荧光蛋白(pEGFP1)报告基因载体,比较各启动子转录活性,从而确定hCREG核心启动子区.方法 通过查询美国国立生物技术信息中心(NCBI)数据库hCREG序列并结合启动子特点,获得长度为2003(–1925/+78)bp的启动子片段.利用PCR法及双酶切法截短5个启动子片段并克隆至pEGFP1中,构建pEGFP1_hCREG_2003、pEGFP1_hCREG_945、pEGFP1_hCREG_586、pEGFP1_hCREG_478、pEGFP1_hCREG_358报告基因载体质粒.并将其与内参质粒pGL4.73[hRluc/SV40]瞬时共转染入293T细胞48 h,荧光显微镜下观察pEGFP1_hCREG启动子报告基因的绿色荧光表达;采用实时定量PCR检测各启动子mRNA的表达,并确定核心启动子区.采用生物信息学方法预测核心启动子区可能结合的转录因子.结果 通过双酶切和基因测序法证实成功构建5个hCREG启动子报告基因载体.荧光显微镜下的观察结果和实时定量PCR结果均显示,pEGFP1_hCREG_586转录活性最高(P0.05),提示–867/–509 bp为负性调控区,–400/–281 bp和–508/–401 bp均存在增强子序列,故hCREG基因核心启动子区位于基因5'上游序列–508/–281 bp区域.生物信息学预测关键启动子区–508/–281 bp可能结合的转录因子为Pax5/P53、C/EBPβ、GR-β、GATA-1、GR-α、c-Jun、PRB/PRA、YY1、RXR-α、AP-2、FOXP3、GR、TFIID、STAT4、c-Ets-1.结论 成功构建了hCREG基因启动子重组质粒,其核心启动子位于–508/–281 bp区域,此区域可结合多个转录因子.

摘要： 目的 用增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标记犬小孢子菌PQ-LRP蛋白,明确PQ-LRP蛋白在犬小孢子菌中的定位.方法 提取犬小孢子菌总RNA,反转录为cDNA作为模板,PCR扩增PQ-LRP基因,将PQ-LRP基因与EGFP基因构成融合基因,连接到pCAMBIA 1300质粒载体,采用根癌农杆菌转化法对犬小孢子菌进行转化,使融合基因LRP-EGFP在真菌通用启动子(Ptrpc)和终止子(Ttrpc)调控下在犬小孢子菌中整合型表达,激光共聚焦显微镜检测融合蛋白的细胞定位.结果 成功构建表达载体pCAMBIA-LRP-EGFP,融合基因LRP-EGFP在犬小孢子菌中获得整合型表达.激光共聚焦显微镜下LRP-EGFP的荧光信号呈颗粒状或团块状集中于犬小孢子菌的细胞膜上.结论 LRP-EGFP融合基因在犬小孢子菌中成功表达,且PQ-LRP蛋白定位于犬小孢子菌细胞膜上.%Objective To determine the location of PQ-LRP protein in Microsporum canis using the enhanced green fluorescent protein(EGFP)as a marker.Methods The total RNA was extracted from Microsporum canis,and reversely transcribed into cDNA.The PQ-LRP gene was amplified by PCR using the above cDNA as the template.The fusion gene of PQ-LRP gene and EGFP gene was linked to the plasmid pCAMBIA 1300.Microsporum canis was subjected to Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation,in order to achieve the integrated expression of the fusion gene LRP-EGFP in Microsporum canis under the regulation by the fungal universal promoter Ptrpc and terminator Ttrpc.Laser-scanning confocal microscopy was conducted to determine the cellular localization of the fusion protein.Results The expression vector pCAMBIA-LRP-EGFP was successfully constructed,and the fusion gene LRP-EGFP was expressed integratedly in Microsporum canis.Laser-scanning confocal microscopy showed that fluorescence signals of LRP-EGFP were concentrated on the cell membrane of Microsporum canis,giving a granular or cluster-like appearance.Conclusion The infusion gene LRP-EGFP can be successfully expressed in Microsporum canis,and PQ-LRP protein is located on the cell membrane of Microsporum canis.

摘要： 目的构建人血小板第4因子(PF4)基因启动子-绿色荧光蛋白(GFP)报告基因载体PLVX-PF4-promoter-GFP,并检测其转录活性。方法在NCBI数据库中获得人PF4基因启动子5’端非编码区包含转录起始位点在内的-245~+49 bp的DNA序列。以正常人全血基因组DNA为模板,利用PCR扩增该序列,与GFP序列连接并插入到PLVX-tight-puro载体上,构建重组质粒PLVX-PF4-promoter-GFP。将其包装慢病毒并感染MEG01细胞,用嘌呤霉素筛选出稳转细胞株,并用12-肉豆蔻酰-13-乙酸佛波酯(PMA)诱导MEG01细胞分化成熟,通过流式细胞术检测GFP表达率,从而验证报告基因的转录活性。结果构建的载体PLVX-PF4-promoter-GFP经酶切鉴定及测序结果比对完全正确,将其转入MEG01细胞,经药物筛选获得了MEG01-PF4-GFP细胞株。流式细胞术检测结果表明,正常培养条件下的MEG01-PF4-GFP细胞中GFP阳性细胞率低[(5.467±0.2603)%],该细胞经PMA诱导分化后,GFP阳性细胞率显著升高[(24.93±2.571)%]。结论成功构建了人PF4启动子-GFP报告基因载体,为后续深入研究PF4基因的调控机制及巨核细胞发育分化的分子生物学机制奠定了基础。

摘要： 目的建立一种高效慢病毒转染小鼠肺的方法。方法采用绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)和萤光素酶(luciferase,Luc)双基因标记慢病毒载体,通过293 FT细胞体外包装带有报告基因的慢病毒颗粒。选取BALB/c小鼠30只,每组15只,随机分为高压喷雾注射组和普通注射组,小鼠手术暴露气管,经气道注射报告基因标记的慢病毒颗粒,观察慢病毒转染至肺后2、4、6、8、10、12 h小鼠存活率和呼吸系统表现,并在转染后24 h体外活体荧光成像仪检测报告基因在小鼠体内的发光强度。结果荧光显微镜下观察,见多数细胞表达GFP,并见细胞融合现象,少量细胞悬浮,病毒滴度为5×107U/ml。活体荧光成像结果显示,与普通注射方法相比,高压喷雾注射组报告基因荧光强度均匀分布在肺中,荧光强度较高,两组间表达强度比较差异有统计学意义(P=0.0095);且高压喷雾注射组小鼠气促、鼻唇黏膜发绀(cyanosis)较普通注射组恢复快,两组12 h存活率分别为80%和50%。结论高压喷雾注射技术转染慢病毒颗粒至小鼠肺的技术更为高效,可用于建立外源基因小鼠肺转染模型。

摘要： Objective To explore a high-throughput method for quantitative analysis of autophagosomes.Methods Green fluorescent protein-light chain 3(GFP-LC3)transgenic murine keratinocytes were randomly divided into 4 groups:control group receiving no treatment,starvation group subjected to starved culture,20 J/cm2 ultraviolet A (UVA) group treated with 20 J/cm2 UVA radiation,and 40 J/cm2 UVA group treated with 40 J/cm2 UVA radiation.After 6-hour treatment,the cells were fixed,and images were acquired by confocal laser scanning microscopy.A macro was created by the ImageJ software to automatically quantify the GFP-LC3 puncta in the cells and the number of cells.Then,the level of autophagy was compared among different groups.Results By using the macro created by the ImageJ software,autophago-somes in the keratinocytes were successfully identified and quantified.Less than 0.6 second was needed for analyzing an image of 4.2 mega pixels in a test computer.The average number of autophagosomes in keratinocytes was significantly higher in the starvation group,20-J/cm2 UVA group and 40-J/cm2 UVA group than in the control group whether with the treatment with pepstatin A (F =20.05,P ＜0.05) or not (F =5.01,P ＜ 0.05).This method could successfully differentiate the autophagy levels among the starvation group,UVA irradiation groups and control group.Conclusion A new high-throughput method,which can rapidly and accurately quantify GFP-LC3 puncta in cells,is established successfully to quantificationally detect autophagy.%目的 探索一种高通量定量检测细胞自噬小体数量的方法.方法 将绿色荧光蛋白-轻链蛋白3(GFP-LC3)转基因小鼠的角质形成细胞分为对照组(不接受照射或饥饿处理)、饥饿组(给予饥饿处理)、20 J/cm2长波紫外线(UVA)照射组和40 J/cm2 UVA照射组.处理后6h,将细胞固定后在共聚焦显微镜下采集图片.用ImageJ软件编辑宏指令对细胞内GFP-LC3绿色荧光点及细胞进行自动计数,并比较不同组间自噬水平.结果 利用ImageJ软件编辑的宏指令可以成功识别并计数荧光图片中的自噬小体.在测试计算机上分析一张420万像素的图片仅需不到0.6 s.饥饿组、20 J/cm2UVA照射组和40 J/cm2 UVA照射组平均自噬小体数量高于对照组,未加胃抑素A时各组间比较,F=5.01,P＜ 0.05;加入胃抑素A时各组间比较,F=20.05,P＜0.05.该方法可以成功区分饥饿组、UVA照射组和对照组的自噬水平差异.结论 成功为自噬研究提供了一种新的高通量定量检测方法,该方法能够快速准确地检测细胞自噬荧光点.

摘要： 本发明提供了一种新的荧光蛋白质。本发明的新的蛋白质的特征在于它是下述蛋白质(F1)。(F1)：包含由SEQ ID NO：1表示的氨基酸序列的蛋白质，其中，在所述由SEQ ID NO：1表示的氨基酸序列中，位于第52位的氨基酸残基Xaa52是任意氨基酸残基，位于第133位的氨基酸残基Xaa133是任意氨基酸残基，并且位于第154位的氨基酸残基Xaa154是任意氨基酸残基。

摘要： 本发明公开了一种链霉亲和素标记的结合藻红胆素(PEB)的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质的制备方法，是通过应用藻胆蛋白beta155裂合酶催化藻红胆素与链霉亲和素标记的藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白共价结合，制备链霉亲和素标记的结合PEB的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质。本发明的方法应用生物过程生产藻红蓝蛋白类荧光蛋白质，是一种环境友好的生产方法。藻红蓝蛋白类荧光蛋白质能应用于食品、保健与医药功能材料领域，特别是应用为生物和医学分子监测领域的荧光探针。

摘要： 本发明公开一种高稳定性藻蓝蛋白类融合荧光蛋白质的制备方法，属于分子生物学技术领域。包括以下步骤：1)将藻蓝蛋白脱辅基蛋白基因和麦芽糖结合蛋白融合，并与色基裂合酶基因(cpcE和cpcF)克隆到表达载体的第一个表达框，藻胆素生物合成酶基因(hoxl和pcyA)克隆到同一载体的第二个表达框，得到一个含有多个相关基因的表达质粒；2)将上述表达质粒转化大肠杆菌后，筛选得到高产菌，应用此工程菌发酵，经蛋白的分离纯化，得到荧光类融合藻蓝蛋白。本发明有以下优点：1.提高了重组荧光蛋白的水溶性和稳定性；2.缩短生产周期，节约能源，利用率高。

摘要： 本发明公开了一种结合藻红胆素(PEB)的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质的制备方法，是通过应用藻胆蛋白beta裂合酶催化藻红胆素与藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白共价结合，制备结合PEB的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质。本发明的方法应用生物过程生产藻红蓝蛋白类荧光蛋白质，是一种环境友好的生产方法。藻红蓝蛋白类荧光蛋白质能应用于食品、保健与医药功能材料领域，特别是应用为生物和医学分子监测领域的荧光探针。

摘要： 本发明公开了一种结合藻红胆素的别藻蓝蛋白类荧光蛋白质的制备方法，是通过应用藻胆蛋白beta裂合酶催化藻红胆素(PEB)与别藻蓝蛋白类脱辅基蛋白共价结合，制备结合PEB的别藻蓝蛋白类荧光蛋白质；本发明的方法应用生物过程生产别藻蓝蛋白类荧光蛋白质，是一种环境友好的生产方法；别藻蓝蛋白类荧光蛋白质能应用于食品、保健与医药功能材料领域，特别是应用为生物和医学分子检测领域的荧光探针。

摘要： 本发明公开了一种链霉亲和素标记的结合藻红胆素的藻蓝蛋白类荧光蛋白质的制备方法，通过应用藻胆蛋白beta裂合酶催化藻红胆素与链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类脱辅基蛋白共价结合，制备链霉亲和素标记的结合PEB的藻蓝蛋白类荧光蛋白质。本发明的方法应用生物过程生产藻蓝蛋白类荧光蛋白质，是一种环境友好的生产方法。藻蓝蛋白类荧光蛋白质能应用于食品、保健与医药功能材料领域，特别是应用为生物和医学分子监测领域的荧光探针。

摘要： 本发明公开了一种结合藻红胆素(PEB)的藻蓝蛋白类荧光蛋白质的制备方法，是通过应用藻胆蛋白beta155裂合酶催化藻红胆素与藻蓝蛋白类脱辅基蛋白共价结合，制备结合PEB的藻蓝蛋白类荧光蛋白质。本发明的方法应用生物过程生产藻蓝蛋白类荧光蛋白质，是一种环境友好的生产方法，藻蓝蛋白类荧光蛋白质能应用于食品、保健与医药功能材料领域，特别是应用为生物和医学分子监测领域的荧光探针。

摘要： 本发明涉及藻蓝蛋白类荧光蛋白质领域，具体为一种生产具有荧光活性和链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质的方法及应用，通过将链霉亲和素合成基因、藻蓝蛋白亚基合成基因、催化酶合成基因、色基合成基因、标签合成基因等重组于同一表达质粒中，实现多基因的组合表达，通过对诱导、纯化条件的优化，制备具备稳定荧光活性的融合蛋白。采用单一质粒完成荧光活性融合藻胆蛋白的组合表达，避免多质粒在工程菌株中的稳定性及各基因表达的不同步问题，减少发酵过程中的抗生素的使用，有效提高了荧光蛋白质的稳定性，大幅降低藻蓝蛋白类荧光标记制剂的制作成本。在生物医学领域，尤其在荧光探针的生产方面具有良好的实用价值和应用前景。

摘要： 本发明提供了一种新的荧光蛋白质。本发明的新的蛋白质的特征在于它是下述蛋白质(F1)。(F1)：包含由SEQ ID NO：1表示的氨基酸序列的蛋白质，其中，在所述由SEQ ID NO：1表示的氨基酸序列中，位于第52位的氨基酸残基Xaa52是任意氨基酸残基，位于第133位的氨基酸残基Xaa133是任意氨基酸残基，并且位于第154位的氨基酸残基Xaa154是任意氨基酸残基。

摘要： 本发明涉及藻蓝蛋白类荧光蛋白质领域，具体为一种生产链霉亲和素标记的藻蓝蛋白类荧光蛋白质的方法及应用。本发明通过将链霉亲和素合成基因、藻蓝蛋白亚基合成基因、催化酶合成基因、色基合成基因重组于同一表达质粒中，实现多基因的组合表达，通过对诱导、纯化条件的优化，制备具备稳定荧光活性的融合蛋白。采用单一质粒完成荧光活性融合藻胆蛋白的组合表达，避免了多质粒在工程菌株中的稳定性及各基因表达的不同步问题，减少发酵过程中的抗生素的使用。本发明的方法有效提高了荧光蛋白质的稳定性，同时大幅降低了藻蓝蛋白类荧光标记制剂的制作成本。在生物医学领域，尤其在荧光探针的生产方面具有良好的实用价值和应用前景。