红色荧光蛋白

摘要： 以类弹性蛋白(elastin-like polypeptide,ELP)作为非色谱纯化标签,分离纯化红色荧光蛋白mCherry.ELP与△I-CM(intein cleavage mutant)的N端连接,mCherry片段与△I-CM的C端连接,在ELP的N端插入GFP片段,用于检测蛋白纯度.采用低温诱导的方式实现重组蛋白在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中可溶性表达.可逆相变循环,分离纯化融合蛋白GFP-ELP-IN-mCherry,通过改变温度和pH诱导内含肽自剪切,再利用ELP的特性去除GFP-ELP-IN标签,得到目的蛋白mCherry.学生通过本实验可掌握蛋白质分离纯化技术,提高了动手实践的能力.

摘要： 目的:构建淋巴细胞活化因子3(LAG3)-mCherry红色荧光蛋白的LAG3-mCherry慢病毒表达载体,转染HEK293T细胞获得稳定表达LAG3-mCherry融合蛋白的细胞系,探讨LAG3-mCherry融合蛋白在HEK293T细胞中的定位。方法:将LAG3质粒和带有mCherry的慢病毒载体分别用限制性内切酶EcoRⅠ和NotⅠ进行双酶切,构建pEZ-LAG3-mCherry表达载体。将测序正确的质粒利用Lipofectamine 3000转染HEK293T细胞,利用荧光显微镜观察LAG3-mCherry在HEK293T细胞中的表达定位,Western blotting法检测LAG3-mCherry融合蛋白的表达情况。结果:酶切鉴定结果,电泳后重组质粒双酶切后可见约为8012和2066 bp大小的2条DNA条带,与pEZ-Lv-mCherry载体及LAG3基因片段大小相符;DNA测序结果,LAG3基因成功插入到慢病毒表达载体中。荧光显微镜观察,LAG3-mCherry融合蛋白主要在HEK293T细胞膜上表达,少量蛋白滞留在细胞质中。Western blotting法检测,在转染pEZ-LAG3-mCherry质粒中检测到LAG3对应特异性条带。结论:成功构建了LAG3-mCherry慢病毒表达载体pEZ-LAG3-mCherry。通过稳定转染成功制备了稳定表达LAG3-mCherry的细胞系。LAG3-mCherry融合蛋白主要分布于HEK293T细胞的细胞膜上。

摘要： 用于黑曲霉遗传操作的筛选标记基因非常有限,而基因改造往往涉及诸多基因的敲除或表达,有限的筛选标记基因难以满足需要。该文构建了以pyrG为筛选标记的黑曲霉遗传转化系统,并利用该系统使红色荧光蛋白rfp在黑曲霉中成功表达。首先,运用同源重组原理完全敲除pyrG基因,在含有5-氟乳清酸和尿苷/尿嘧啶的培养基平板进行筛选,获得1株稳定遗传的尿苷/尿嘧啶营养缺陷型菌株黑曲霉ng-1。然后构建了以pyrG作为回补标记,以三磷酸甘油醛脱氢酶启动子gpdA来调节rfp基因表达的质粒,将质粒转入农杆菌AGL1并侵染黑曲霉菌株ng-1,成功获得了黑曲霉rfp表达菌株,表明pyrG筛选标记可成功用于黑曲霉的遗传转化。

摘要： 目的 构建携带红色荧光蛋白(mCherry)标签的类弹性蛋白(ELP)原核表达载体,并表达纯化ELP-mCherry融合蛋白,探讨ELP-mCherry融合蛋白与细胞的相容性.方法 对利用限制性内切酶Xba I和Xho I对mCherry质粒和pET28a-ELP载体同时进行双酶切,将酶切产物回收、连接并转化DH5α大肠杆菌感受态细胞,构建重组质粒pET28a-ELP-mCherry;将重组质粒转化到BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞中,诱导表达ELP-mCherry融合蛋白;利用可逆转变循环(ITC)法对ELP-mCherry融合蛋白进行纯化;通过MTT法探讨ELP-mCherry融合蛋白与人胚肾上皮细胞HEK293T和小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3的细胞相容性.结果 DNA测序结果 显示成功构建了ELP-mCherry原核表达载体;利用BL21(DE3)大肠杆菌表达系统成功表达ELP-mCherry融合蛋白,通过ITC法纯化得到了高纯度融合蛋白.MTT结果 表明:在所有ELP-mCherry蛋白测试浓度下,HEK293T和NIH3T3细胞存活率接近或超过100％.结论 成功构建ELP-mCherry原核表达载体,成功表达并纯化得到高纯度的ELP-mCherry融合蛋白,ELP-mCherry融合蛋白在HEK293T和NIH3T3细胞中具有良好的细胞相容性.

摘要： 前期研究发现,随着病毒的不断传代,插入到鸭肠炎病毒(DEV)UL2基因中的报告基因绿色荧光蛋白(GFP)会发生点突变或缺失,严重影响了重组DEV的反向筛选.为筛选更加稳定的报告基因,通过酶切连接的方法以表达红色荧光蛋白(RFP)的表达盒取代重组质粒pT-UL2-GFP-gpt中的GFP-gpt表达盒,构建表达RFP的UL2基因缺失转移载体pT-UL2-RFP.该转移载体与DEV共转染鸡胚成纤维细胞(CEF)后,经克隆纯化获得表达RFP的重组DEV.通过测定重组病毒及其亲本毒的一步生长曲线及用PCR测定不同代次重组病毒的RFP序列发现,重组病毒在细胞和上清中的病毒含量分别在48 h和84 h达到峰值106.4 TCID50/0.1 mL和106.83 TCID50/0.1 mL,与亲本毒无明显差异(P>0.05);RFP表达盒在重组DEV连续传12代后仍可稳定表达,表明在DEV UL2区域插入RFP表达盒不影响病毒的繁殖,且RFP表达盒比GFP表达盒更适合作为报告基因.该研究结果对重组DEV的构建、筛选具有重要意义.

摘要： 采用PCR技术从鱼腥藻(Anabaena sp.PCC7120)中扩增蓝细菌光敏色素基因片段alr1966gaf2,将alr1966gaf2插入到pET-30a(+)载体中,构建表达质粒pET-alr1966gaf2。最后将Alr1966GAF2与HO1、PcyA在E.coli BL21(DE3)中共表达获得色素蛋白Alr1966GAF2,并对该蛋白的光化学性质进行分析。结果显示,色素蛋白Alr1966GAF2结合色素为藻蓝胆素(phycoerythrobilin,PCB)或藻紫胆素(phycoviolobilin,PVB),在3种不同吸收态15Z-P428 nm、中间态和15E-P514 nm之间具有顺序可逆光效应。通过定点突变技术将DXCF基序中的保守性Cys突变为Ala,获得了突变体Alr1966GAF2(C72A)。将Alr1966GAF2(C72A)与HO1、PcyA共表达,获得色素蛋白Alr1966GAF2(C72A)。研究结果表明Alr1966GAF2(C72A)结合色素为PCB,Alr1966GAF2(C72A)-PCB具有较强的荧光活性,其荧光量子的产率高达0.11。Alr1966GAF2(C72A)不仅能够共价结合PCB,还可以结合胆绿素(Biliverdin,BV),均具有较强的红色荧光活性。

摘要： 采用PCR技术从鱼腥藻(Anabaena sp.PCC7120)中扩增蓝细菌光敏色素基因片段alr1966gaf2,将alr1966gaf2插入到pET-30a(+)载体中,构建表达质粒pET-alr1966gaf2.最后将Alr1966GAF2与HO1、PcyA在E.coli BL21 (DE3)中共表达获得色素蛋白Alr1966GAF2,并对该蛋白的光化学性质进行分析.结果 显示,色素蛋白Alr1966GAF2结合色素为藻蓝胆素(phycoerythrobilin,PCB)或藻紫胆素(phycoviolobilin,PVB),在3种不同吸收态15Z-P428nm、中间态和15E-P514nm之间具有顺序可逆光效应.通过定点突变技术将DXCF基序中的保守性Cys突变为Ala,获得了突变体Alr1966GAF2(C72A).将Alr1966GAF2(C72A)与HO1、PcyA共表达,获得色素蛋白Alr1966GAF2 (C72A).研究结果表明Alr1966GAF2 (C72A)结合色素为PCB,Alr1966GAF2(C72A)-PCB具有较强的荧光活性,其荧光量子的产率高达0.11.Alr1966GAF2 (C72A)不仅能够共价结合PCB,还可以结合胆绿素(Biliverdin,BV),均具有较强的红色荧光活性.

摘要： [背景]乳链菌肽主要是由乳酸乳球菌生产的一类多肽,对革兰氏阳性菌有抑菌作用,是目前联合国粮食及农业组织/世界卫生组织唯一批准使用的天然食品防腐剂.但是其产量低、缺乏简便高效的检测方法,限制了其研究和应用.[目的]构建一种可输出肉眼可见红色荧光的细胞分子传感器,以期能简单方便地检测样品中的乳链菌肽,同时应用该传感器筛选乳链菌肽生产菌株.[方法]用Golden-Gate克隆方法构建含乳链菌肽诱导启动子和下游红色荧光蛋白基因(两种)的载体,转入Lactococcus lactis中.用细胞传感器筛选可能的乳链菌肽生产菌株.[结果]构建的两种乳链菌肽细胞分子传感器都能对2-200 ng/mL乳链菌肽有灵敏的响应,可用于定量测定.两种传感器的最大荧光强度和表型也有所不同.利用细胞传感器确定了Lactococcus lactis ATCC 11454乳链菌肽的产生,同时排除了一个能产其他抗菌化合物的菌株.[结论]构建的细胞分子传感器能特异性地响应乳链菌肽,并能简单快速地筛选乳链菌肽菌株.

摘要： 目的 建立红色荧光蛋白mCherry在衣原体中稳定表达的方法,并使用荧光菌株Cm-mCherry构建有效的衣原体感染模型.方法 构建含有红色荧光蛋白mCherry的重组质粒pmCher-ry::CM,利用氯化钙法将pmCherry::CM转化至衣原体质粒缺失株CMUT中,经过筛选与纯化得到荧光菌株Cm-mCherry.Cm-mCherry感染HeLa229细胞后观察包涵体中红色荧光的发光情况,并与间接免疫荧光染色法比较,评估细胞感染模型构建是否成功;Cm-mCherry感染小鼠后,通过测定下生殖道载菌量、冷冻切片观察上生殖道衣原体红色荧光、分离生殖道评价输卵管积水发病情况,确定Cm-mCherry的感染力、侵袭力与致病性,评估动物感染模型构建是否成功.结果 红色荧光蛋白mCher-ry在转化株Cm-mCherry中稳定表达,红色荧光蛋白标记法与间接免疫荧光染色法一致度高;Cm-mCherry小鼠感染模型中,感染率为100％(10/10),下生殖道载菌量可稳定保持高水平,在上生殖道冷冻切片中可观察到带有红色荧光的包涵体,输卵管积水发病程度与Cm野生株差异无统计学意义(P＞0.05),证实Cm-mCherry有较好的感染力、侵袭力与致病性.结论 成功建立红色荧光蛋白mCherry在衣原体中稳定表达的方法,转化后的荧光菌株Cm-mCherry有较好的感染力、侵袭力与致病性,可用于衣原体细胞、动物感染模型的构建,为研究衣原体感染机制提供良好的实验工具.

摘要： 本实验首次构建pCX-mRFP1-pgk—neoR基因，生产表达红色荧光蛋白的小型猪，为以后基因敲除的研究提供理想动物模型。

摘要： 目的：基于慢病毒介导的转基因方法制备红色荧光蛋白(mRFP)转基因小鼠以建立基于该转基因方法制作转基因小鼠的技术平台。rn 方法：将携带mRFP基因的慢病毒注射入ICR小鼠单细胞受精卵卵周隙以感染受精卵，胚胎移植进假孕母鼠以获得仔代小鼠，然后应用小动物活体成像仪、体视荧光显微镜和PCR等鉴定并获得mRFP 转基因鼠。rn 结果：移植卵周隙注射有慢病毒的胚胎40枚给2 只假孕母鼠，共获得仔鼠6 只；利用体视荧光显微镜检测mRFP 表达，在蛋白水平证实6只F0代中，2 只(R3和R4) 鼠耳和胡须高表达mRFP，其余的弱表达mRFP(R1、R2和R5)或荧光强度(R6)与野生型ICR小鼠无明显差别，而DNA 水平检测证实，6 只F0代中，5 只(R1、R2、R3、R4和R5)基因组中整合有外 源转基因hUbmRFP，预示基因型鉴定结果很好验证了体视荧光显微镜鉴定结果。rn 结论：本实验室建立 了基于慢病毒法快速制备转基因小鼠的技术平台，这为针对不同基因建立相应转基因小鼠以实现恒定或条件性的转基因过表达或RNA干涉(RNAi)，并进而在体内解析相应基因功能和建立人类疾病模型等奠定了坚实基础。

摘要： 目的：构建两种在哺乳动物细胞中表达24-脱氢胆固醇还原酶(DHCR24)/GFP及DHCR24/REP融合蛋白的质粒，即在DHCR24的N端融合了红色荧光蛋白(RFP)的pDsred-C1-DHCR24表达载体和在DHCR24的C端融合绿色荧光蛋白(GFP)的pEGFP-N1-DHCR24表达载体。将两种质粒共转染至小鼠成神经瘤细胞株N2A中，观察DHCR24融合蛋白的表达，确定其细胞定位，为进一步研究其拓扑空间结构奠定基础。方法：从人肝癌细胞株HepG2中分别扩增出DHCR24的全长cDNA序列，扩增产物进行T-A克隆，经酶切、DNA测序鉴定正确后，将DHCR24的cDNA片段分别酶切后连接入pEGFP-N1-DHCR24和pDsred-Cl-DHCR24两种真核表达载体。随后用这两种载体转染N2A细胞。通过免疫细胞化学荧光确定其亚细胞定位。结果：重组质粒经酶切和测序鉴定正确并在N2A细胞中高量表达，免疫荧光结果证明DHCR24分布于内质网中。结论：成功构建了两种表达DHCR24/荧光蛋白的融合蛋白的质粒。为研究DHCR24在内质网的拓扑空间结构及其抗内质网应激分子机制提供了一种重要的工具。

摘要： 利用高保真PCR技术克隆了唐鱼(Tanichthys albonubes)、斑马鱼(Danio rerio)和罗非鱼(Oreochromis niloticus)β-actin 5'端侧翼区的启动调控区及部分开放阅读框,测序结果表明,所克隆得到的三种鱼类β-actin其长度分别为1465bp、1654bp和1733bp.但均包括一段长为108bp左右的β-actin基因上游调控序列、不翻译的第一个外显子和第一个内含子以及部分开放阅读框(长度为90bp).其中上游调控序列中含有对转录过程起着重要作用的元件:CCAAT Box,TATA Box,CArG Box.开放阅读框均编码一段含30个氨基酸的多肽,此多肽具有高度的保守性,其中唐鱼的与斑马鱼的同源性为100％;与罗非鱼的同源性为96.7％.将唐鱼β-actin的启动子插入不含启动子的红色荧光表达载体pDsRed2-1中,构建以红色荧光蛋白为报告基因的重组表达载体,序列测定证实启动子已正确插入到表达载体中.通过显微注射技术将带有唐鱼启动子的红色荧光表达载体(TB-Red)线性化后注射到唐鱼的受精卵中,荧光显微镜下观察外源基因在胚胎的表达.结果表明:在孵化后72h可观察到唐鱼仔鱼体表发出的红色荧光,证实了唐鱼β-actin基因启动子具有有效的基因表达活性.

摘要： 本实验在昆虫piggyBac转座子载体体系上，以家蚕肌动蛋白基因A4做为启动子，利用RFP作为报告基因，建立了一套快速检测DsRed表达及筛选转基因家蚕阳性个体的体系.

摘要： 本实验在昆虫piggyBac转座子载体体系上，以家蚕肌动蛋白基因A4做为启动子，利用RFP作为报告基因，建立了一套快速检测DsRed表达及筛选转基因家蚕阳性个体的体系.

摘要： 本实验在昆虫piggyBac转座子载体体系上，以家蚕肌动蛋白基因A4做为启动子，利用RFP作为报告基因，建立了一套快速检测DsRed表达及筛选转基因家蚕阳性个体的体系.

摘要： 本实验在昆虫piggyBac转座子载体体系上，以家蚕肌动蛋白基因A4做为启动子，利用RFP作为报告基因，建立了一套快速检测DsRed表达及筛选转基因家蚕阳性个体的体系.

摘要： 一种测量活细胞内青色荧光蛋白和黄色荧光蛋白浓度比的方法，该方法是利用三通道荧光共振能量转移显微镜测量活细胞内青色荧光蛋白和黄色荧光蛋白浓度比的方法，包括下列步骤：①测量三通道荧光共振能量转移显微镜漏过系数；②利用三通道荧光共振能量转移显微镜测量活细胞内CFP蛋白与YFP蛋白浓度之比。本发明方法的测量结果表明：校正了CFP和YFP荧光的串扰，校正了由于FRET的发生而引起的CFP荧光的减少和YFP荧光的增加，测量的结果稳定，标准误差比较小。

摘要： 本发明提供了一种基于绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白的双荧光共定位系统。该组用于检测待测蛋白是否相互作用的融合蛋白，为如下1)和2)：1)由荧光蛋白A、待测蛋白A和核输出信号组成；2)由荧光蛋白B、待测蛋白B和核定位信号组成；所述荧光蛋白A与所述荧光蛋白B为发不同颜色荧光的荧光蛋白；所述1)所示融合蛋白片段与2)所示融合蛋白片段分别独立包装；所述待测蛋白A和待测蛋白B是待检测是否相互作用的两个蛋白。本发明方法检测结果可靠，操作简单，一目了然地看到共定位现象，易于判别，方便快捷。

摘要： 本发明公开了一种远红色荧光蛋白、融合蛋白、分离的核酸、载体和应用，属于生物医学光学与分子影像学技术领域。本发明公开的远红色荧光蛋白相对于荧光蛋白mMaroon1包括以下氨基酸突变位点：S128A、R157Y、F194A、D223T、P225G以及第226‑234位氨基酸片段的缺失。本发明提供的远红色荧光蛋白具有良好的单体性，易于与其他蛋白融合或相互作用，能够提高成像效率和改善成像效果。

摘要： 本发明公开了一种红色荧光蛋白、融合蛋白、分离的核酸、载体和应用，属于生物医学光学与分子影像学技术领域。本发明公开的红色荧光蛋白相对于荧光蛋白mRuby3包括以下氨基酸突变位点：N8E，R10P，E114V，V116I，T177E以及R179K中的一个或多个的组合。本发明提供的红色荧光蛋白具有较高的亮度、成熟率以及消光系数等光物理性质，可用于蛋白标记与成像、或作为荧光共振能量转移受体或供体等领域进行应用，具有较好的荧光共振能量转移效率。

摘要： 本发明公开了一种红色荧光蛋白类双光子光敏染料RFP‑Ac及其制备方法和应用，所述红色荧光蛋白类双光子光敏染料RFP‑Ac包含吩噻嗪、乙烯基苯与荧光蛋白亚甲基咪唑啉酮的共轭结构，同时在荧光生色团端基引入丙烯酸芳基酯作为活性硫醇识别位点和光敏剂靶向基团。本发明的红色荧光蛋白类光敏染料分子RFP‑Ac具有双光子吸收特性，斯托克斯位移超过200 nm，抗干扰能力强，灵敏度高，细胞毒性小，生物相容性好，单线态氧产率较高，可作为性能优异的双光子光敏染料和荧光探针，在近红外波段荧光传感、内源性或外源性生物活性硫醇检测、双光子荧光成像、荧光标记、双光子光动力治疗方面具有广泛应用。

摘要： 本发明提供了一种基于绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白的双荧光共定位系统。该组用于检测待测蛋白是否相互作用的融合蛋白，为如下1)和2)：1)由荧光蛋白A、待测蛋白A和核输出信号组成；2)由荧光蛋白B、待测蛋白B和核定位信号组成；所述荧光蛋白A与所述荧光蛋白B为发不同颜色荧光的荧光蛋白；所述1)所示融合蛋白片段与2)所示融合蛋白片段分别独立包装；所述待测蛋白A和待测蛋白B是待检测是否相互作用的两个蛋白。本发明方法检测结果可靠，操作简单，一目了然地看到共定位现象，易于判别，方便快捷。

摘要： 本发明公开了一种构建具有表达荧光素酶和红色荧光蛋白的重组巨噬细胞的转基因小鼠的方法。本发明提供了序列1所示的特异DNA分子。本发明还提供了具有所述特异DNA分子的重组质粒，即打靶载体。本发明还保护一种制备转基因小鼠的方法：在小鼠受精卵中导入打靶载体、特异sgRNA和Cas9 mRNA，然后移植至代孕小鼠子宫内；代孕小鼠分娩得到子代鼠，从中筛选转基因小鼠；所述特异sgRNA的靶序列结合区如序列表的序列3中第1‑17位核苷酸所示。所述转基因小鼠的巨噬细胞表达荧光素酶和红色荧光蛋白。本发明得到的转基因小鼠，可以作为研究巨噬细胞的鼠模型，可以作为研究炎症反应的鼠模型，从而用于机理研究、药物研发或诊断试剂研发。

摘要： 本发明公开了一种在酵母中建立基于红色荧光蛋白的双分子荧光互补系统的方法。该方法包括：将yEmRFP(SEQ ID No.1)分成N端(第1‑159位)和C端(第160‑236位)；在N端编码基因5’或3’端通过连接序列(编码SEQ ID No.2所示连接肽)连接目的蛋白A的编码基因，形成融合基因片段A；在C端编码基因5’或3’端通过所述连接序列连接目的蛋白B的编码基因，形成融合基因片段B；将融合基因片段A和B导入受体酵母细胞，培养所得转基因酵母细胞，检测其是否产生红色荧光，若产生红色荧光，则目的蛋白A与B互作；若不产生红色荧光，则目的蛋白A与B不互作。本发明建立的BiFC技术具有较高的敏感性和特异性，适合于在酵母中开展蛋白质相互作用筛选。

摘要： 本发明公开了一种远红色荧光蛋白、融合蛋白、分离的核酸、载体和应用，属于生物医学光学与分子影像学技术领域。本发明公开的远红色荧光蛋白相对于荧光蛋白mMaroon1包括以下氨基酸突变位点：S128A、R157Y、F194A、D223T、P225G以及第226‑234位氨基酸片段的缺失。本发明提供的远红色荧光蛋白具有良好的单体性，易于与其他蛋白融合或相互作用，能够提高成像效率和改善成像效果。

摘要： 本发明公开了一种红色荧光蛋白、融合蛋白、分离的核酸、载体和应用，属于生物医学光学与分子影像学技术领域。本发明公开的红色荧光蛋白相对于荧光蛋白mRuby3包括以下氨基酸突变位点：N8E，R10P，E114V，V116I，T177E以及R179K中的一个或多个的组合。本发明提供的红色荧光蛋白具有较高的亮度、成熟率以及消光系数等光物理性质，可用于蛋白标记与成像、或作为荧光共振能量转移受体或供体等领域进行应用，具有较好的荧光共振能量转移效率。