摘要:
目的 了解神经生长因子(nerve growth factor,NGF)受体p75NTR在肝癌组织和肝癌细胞株HepG2中的表达,探讨p75NTR对肝癌细胞凋亡的影响及其关键功能域.方法 收集2006年9月至2008年4月于华中科技大学同济医学院附属同济医院行手术切除患者的肝癌组织标本及对应的癌旁组织标本共26对,应用免疫组织化学法检测trkA和p75NTR在肝癌组织和癌旁组织中的表达.应用Western blot检测NGF在肝癌细胞株HepG2和人胚胎肝细胞株L02中的表达.p75NTR组通过脂质体将p75NTR质粒转染入HepG2细胞中,空载体组将pcDNA3.1空载体转染HepG2细胞,空白对照组为未处理的HepG2细胞.采用Western blot和免疫荧光法检测各组p75NTR的表达.应用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)构建p75NTR肿瘤坏死因子2受体相关因子结构域(tumor necrosis factor 2 receptor associated factor domain,TRAF)、突触后密度蛋白结合结构域(postsynaptic density protein domain,PSD)和Ⅱ型死亡结构域(typeⅡdeath domain,T2DD)突变质粒,转染入HepG2细胞中,应用流式细胞术检测细胞凋亡,采用方差分析和LSD-t检验比较不同功能域点突变对HepG2细胞凋亡的影响.结果 免疫组织化学检测表明TrkA和p75NTR在26对肝癌组织和癌旁组织中均未见明显表达.Western blot结果表明,NGF在HepG2细胞中的相对表达量为0.749±0.302,显著高于L02细胞的0.452±0.290,差异有统计学意义(t=7.421,P=0.037).p75NTR质粒转染入HepG2细胞株后,应用Western blot和免疫荧光进行验证,均可见p75NTR高表达,而空载体组和空白对照组未见明显表达.流式细胞术检测表明,p75NTR组、空载体组和空白对照组细胞凋亡率分别为(25.3±3.6)%、(3.2±0.7)%、(3.0±0.8)%,差异有统计学意义(F=21.740,P<0.001),其中p75NTR组显著高于空载体组和空白对照组(t=25.230、23.156,P均<0.001),空载体组和空白对照组差异无统计学意义(t=0.417,P=0.692).进行p75NTR质粒功能域突变后,空白对照组、空载体组、p75NTR组、TRAF组、T2DD组和PSD组的HepG2细胞凋亡率分别为(3.1% ±0.8)%、(3.5% ±0.6)%、(25.8% ±3.3)%、(24.8% ±4.1)%、(4.4±0.9)%、(23.4% ±3.3)%,差异有统计学意义(F=47.794,P<0.001),其中T2DD组HepG2细胞凋亡率降至与空载体组一致(t=-0.386,P=0.708);而TRAF组和PSD组HepG2细胞凋亡率与p75NTR组接近(t=0.429、0.987,P=0.677、0.347).结论 p75NTR在肝癌组织及HepG2细胞中无明显表达,过表达p75NTR可促进肝癌细胞的凋亡,提示p75NTR在肝癌细胞中发挥肿瘤抑制因子的作用,T2DD是其关键功能域.