碱性果胶酶

摘要： 本文通过优化蛋白浓度测定方法和酶活力测定方法,并以酶解动力学曲线考察方法优化的合理性,以验证终点法测定碱性果胶酶比活的准确性.结果 表明,果胶酶蛋白的最佳测定波长为550 nm,其线性和截距明显优于传统方法,可以忽略果胶酶稀释倍数对蛋白测定的影响.钙离子对该酶具有激活作用;聚半乳糖醛酸比果胶更适合作为酶活力测定底物,其最适pH为9.5,最佳浓度为2 mg/mL,果胶酶活力测定的最佳波长为232 nm,所测酶活力在吸光度值0～2范围内均保持零级反应状态,酶蛋白浓度与酶解速率线性相关且回归曲线截距更接近原点,因此,该测定条件不仅可用于终点法,酶解时间也可灵活掌握,而非拘泥于一个固定的时间段.以酶解30 min为例,其检测限(LOD)为0.15 mU/mL.由于DNS法的灵敏度较低,其半乳糖醛酸标准曲线不过原点,从而导致因酶液稀释倍数不同而产生测量误差,因此,紫外法测定碱性果胶酶活力为最佳选择.

摘要： 为了分离和鉴定对大麻有脱胶效果的碱性果胶酶生产菌株,优化其产果胶酶培养基组成,试验选用果胶作为唯一碳源进行菌株筛选,并采用单因素和正交试验筛选果胶酶发酵培养基组成.结果表明:从沤麻水体中分离到14株具有脱胶能力的细菌,其中X-6菌果胶酶产量最高,该菌革兰氏阴性,大小为0.6～0.8μm×2～3μm,据其生理生化特征和16S rDNA鉴定,该菌株鉴定并被命名为产碱假单胞菌X-6(Pseudomonas alcaligenes X-6),该菌的最佳产果胶酶培养基组成为葡萄糖5 g/L,马铃薯淀粉4 g/L,酵母粉4 g/L,玉米浆4 g/L,氯化钙1.5 g/L,氯化钠0.5 g/L,经验证在该条件下果胶酶活力达到586 U/mL,采用发酵后的粗酶液对大麻进行脱胶试验,残胶率由38.9％降低至17.2％,脱胶效果较好.试验分离和鉴定出一株对大麻脱胶效果较好的菌株,并获得其产果胶酶发酵培养基.

摘要： 本研究组合了基因密码子优化及分子伴侣共表达策略提高碱性果胶酶(PGL)在毕赤酵母中的胞外产量.基于Pichia pastoris密码子偏好性,优化了来源于Bacillus sp.WSHB04-02 PGL高热稳定性突变体K314M基因,并克隆至pPIC9K的EcoR Ⅰ-NotⅠ得到PGL表达载体pPIC9K-PGL.pPIC9K-PGL转化Pichia pastoris GS115(his-)得到重组菌GS115/PGL 14#,胞外PGL酶活达到301.32 U/mL,较优化前提高25.1％.在此基础上,分别及同时共表达分子伴侣内质网蛋白折叠氧化还原辅助因子(ERO1)和泛素共轭酶(UBC1).结果 显示,同时表达ERO1和UBC1(GS115/PGLl-ERO1-UBC1 2#)使重组菌胞外PGL较共表达前提高49.3％,达到450.12 U/mL.应用指数流加策略对重组菌株GS115/PGLl-ERO1-UBC1 2#进行3L罐发酵,诱导发酵96h胞外PGL可达1 362.31 U/mL.研究结果对促进PGL产量的提升及其应用具有重要现实意义.

摘要： 在软件模拟分析的基础上,运用半理性设计转换传统去除N-糖基化的方式,同时在反向转角区引入具有增强芳香族序列(enhanced aromatic sequence,EAS)特征的新N-糖基化,提高了碱性果胶酶(alkaline polygalac-turonate lyase,PGL)的热稳定性,获得了高品质的PGL工程菌.将355位点的苏氨酸突变成突变能低的色氨酸来去除353位点的N-糖基化,酶的半衰期提高了176％,但与目标值仍相距甚远;再将127和137位点同时引入新N-糖基化,使酶的半衰期达到1.35 h,与目标值接近.在酶的反向转角区引入具有EAS特征的新N-糖基化,对提高酶的热稳定性具有显著促进作用.

摘要： Self-assembling amphipathic peptides (SAPs) are a kind of functional peptides,which have alternating hydrophilic and hydrophobic residues and can affect the thermal stability and catalytic properties of the fused enzymes.In this study,several SAPs fusion protein comprising S1 peptide (AEAEAKAKAEAEAKAK) derivatives and Bacillus sp.WSHB04-02 alkaline polygalacturonate lyase (PGL) or PGL-S1 with different linker peptides were constructed,and the effect of the linker peptides and the amino acids composition of SAPs on expression quantity the fusion enzymes were examined.The results showed that the hydrophobicity of hydrophobic amino acids make a critical contribution on the expression of PGL.The SAPs containing the weaker hydrophobic alanine and glycine residues could lead to normal expression of fusion protein.The PGL-S1v1 possessed relative high crude enzyme activity.Compared with the PGL and PGL-S1,the extracellular enzyme activity of PGL-S1v1 was increased by 9-fold and 1.5-fold,respectively.As for the linker peptides,the flexible linkers efficiently enhanced the extracellular expression of the fusion protein compared with the rigid counterparts.The crude enzyme activity of PGL-F-S1 with flexible linker peptide was increased 14-fold compared with PGL.These results suggested that the amino acids composition of SAPs and the flexibility of the linker peptides could effectively affect the expression quantity the fusion protein.%自组装双亲短肽(self-assembling amphipathic peptides,SAPs)是一类亲疏水氨基酸按一定规律分布,具有自聚合效应的氨基酸短肽,融合在酶蛋白N端时,具有促进表达和稳定化的功能.以自组装双亲短肽S1(AE-AEAKAKAEAEAKAK)为出发序列,与来源于Bacillus sp.WSHB04-02的碱性果胶酶(alkaline polygalacturonate lyase,PGL)组成的融合酶为模式蛋白,考察SAPs的氨基酸组成及SAPs融合蛋白内部连接肽(linker peptide)对PGL-SAP融合酶的表达量的影响.结果显示,含有较弱疏水性的甘氨酸和丙氨酸残基的PGL-S1突变体可使融合酶正常表达,其中,含有组氨酸的PGL-S1v1具有相对最高的胞外酶活,较野生型提高了9倍,较PGL-S1提高了1.5倍.连接肽方面,与刚性连接肽相比,含有柔性连接肽的融合酶具有更高的胞外酶活,含有(GGGGS)3的PGL-F-S1融合酶胞外酶活是野生型的14倍.上述结果表明,SAPs的氨基酸组成及融合蛋白之间的连接肽对PGL融合酶的表达具有重要影响.

摘要： 碱性果胶酶可用于苎麻脱胶和棉织物前处理的精练工艺,与传统的高温碱煮相比,具有保护纤维、降低能耗和化学污染的优势,因此获得高表达的碱性果胶酶基因工程菌,低成本生产碱性果胶酶对于纺织工业节能减排具有重要的意义.前期研究工作已经将来源于枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168的碱性果胶酶基因pel经过密码子优化后在毕赤酵母Pichia pastoris GSll5中成功表达.本研究为了提高其表达量,首先利用启动子和信号肽都优化的载体pHBM905BDM进行表达,摇瓶酶活从68 U/mL增加到100 U/mL,qPCR检测转录水平提高了27％.再利用果胶底物平板筛选水解圈大的转化子进行摇瓶发酵获得菌株GS 115-pHBM905BDM-pels4,摇瓶酶活为536 U/mL.随后构建重组质粒pPIC9K-pels,电转化菌株GS 115-pHBM905BDM-pels4,利用抗生素G418平板进行筛选,在含4 mg/mL的G418抗性平板上得到菌株GS 115-pHBM905BDM-pPIC9K-pels1,摇瓶酶活为770 U/mL,qPCR测定含7个拷贝目的基因.最后将该菌株在5L的发酵罐中进行高密度发酵,果胶酶酶活提高至2 271 U/mL.该碱性果胶酶酶活已达到目前酵母表达的最高水平,说明其具有很好的应用于纺织工业的潜力.

摘要： 碱性果胶酶(PGL)是一种重要的工业酶,广泛应用于食品、纺织和造纸等行业.作者将6种双亲短肽(SAP)融合至PGL N端,以期提高PGL在大肠杆菌中的分泌表达效率.得到一株高产菌株PGL-S1,胞外酶活由129.65 U/mL提高到535.47 U/mL,其他5种短肽则酶活降低.通过SDS-PAGE检测发现,PGL-Sl的表达量并没有多大变化,推测可能是催化效率提高引起酶活提高.分析双亲短肽的疏水性指数发现,SAP1的疏水性不同于其他短肽,疏水性是蛋白质发生聚集的主要作用力,能够固定N、C末端,加强与底物的相互作用.推测PGL-S1融合蛋白的表面疏水性提高,促进了对底物的催化效率,具有巨大的工业应用潜力.

摘要： 本研究组合了基因密码子优化及分子伴侣共表达策略提高碱性果胶酶(PGL)在毕赤酵母中的胞外产量.基于Pichia pastoris密码子偏好性,优化了来源于Bacillus sp.WSHB04-02PGL高热稳定性突变体K314M基因,并克隆至pPIC9K的EcoR I-Not I得到PGL表达载体pPIC9K-PGL.pPIC9K-PGL转化Pichia pastoris GS115(his-)得到重组菌GS115/PGL14#,胞外PGL酶活达到301.32U/mL,较优化前提高25.1％.在此基础上,分别及同时共表达分子伴侣内质网蛋白折叠氧化还原辅助因子(ERO1)和泛素共轭酶(UBC1).结果显示,同时表达ERO1和UBC1(GS115/PGLl-ERO1-UBC12#)使重组菌胞外PGL较共表达前提高49.3％,达到450.12U/mL.应用指数流加策略对重组菌株GS115/PGLl-ERO1-UBC12#进行3L罐发酵,诱导发酵96h胞外PGL可达1362.31U/mL.研究结果对促进PGL产量的提升及其应用具有重要现实意义.

摘要： 本研究组合了基因密码子优化及分子伴侣共表达策略提高碱性果胶酶(PGL)在毕赤酵母中的胞外产量.基于Pichia pastoris密码子偏好性,优化了来源于Bacillu sp.WSHB04-02PGL高热稳定性突变体K314M基因,并克隆至pPIC9K的EcoR I-NotI得到PGL表达载体pPIC9K-PGL.pPIC9K-PGL转化Pichia pastoris GS115(his-)得到重组菌GS115/PGL14#,胞外PGL酶活达到301.32U/mL,较优化前提高25.1％.在此基础上,分别及同时共表达分子伴侣内质网蛋白折叠氧化还原辅助因子(ERO1)和泛素共轭酶(UBC1).结果显示,同时表达ERO1和UBC1(GS115/PGLl-ERO1-UBC12#)使重组菌胞外PGL较共表达前提高49.3％,达到450.12U/mL.应用指数流加策略对重组菌株GS115/PGLl-ERO1-UBC12#进行3L罐发酵,诱导发酵96h胞外PGL可达1362.31U/mL.研究结果对促进PGL产量的提升及其应用具有重要现实意义.

摘要： 碱性果胶酶(PGL)是一种重要的工业酶,广泛应用于食品、纺织和造纸等行业.本研究将6种双亲短肽(SAP)融合至PGL N端,以期提高PGL在大肠杆菌中的分泌表达效率.最终得到一株高产菌株重组大肠杆菌(表达PGL-S1),胞外酶活由129.65U/mL提高到535.47U/mL,其他5种短肽则酶活降低.通过SDS-PAGE检测发现PGL-S1的表达量有一定程度降低,因此比酶活的提高可能是胞外PGL酶活提高的重要原因.双亲短肽疏水性指数分析显示,短肽S1的疏水性SAP1的疏水性性明显高于其他双亲短肽,可能对融合蛋白的表面疏水性有重要影响,进而促进了对底物的催化效率.研究显著提高了PGL的产量,亦为其它工业酶的生产与改造提供重要的参考.

摘要： 碱性果胶酶可在碱性条件下水解聚乳糖醛酸α-1,4-糖苷键并释放出可溶性不饱和寡聚乳糖醛酸,在食品工业中具有广泛的应用.本文对枯草芽孢杆菌FJU-212碱性果胶酶基因进行了克隆表达研究.该基因全长1206bp.rn 构建了以AOX1为启动子的毕赤酵母基因工程菌GS115-pPIC9K-PGL，实现PGL的异源表达，酶活为89±5.876 U/mL。为了提高该基因工程菌碱性果胶酶的表达量，对影响表达的各种单因素进行了优化研究。优化后的重组毕赤酵母EIM-60产碱性果胶酶酶活力为425U/mL，较优化前提高了4.8倍。通过硫酸按梯度盐析及HiTrap TM Q(HP)离子柱层析对重组毕赤酵母EIM-60所产碱性果胶酶进行了分离纯化，纯化倍数为4.27,回收率为13.3%，获得了电泳纯的表达产物。为了使碱性果胶酶基因能在毕赤酵母中获得非诱导表达，成功构建了以GAP为启动子的毕赤酵母基因工程菌GS 115-pGAPZαA-PGL，实现PGL的非诱导表达。

摘要： 本文首先从六种不同信号肽amyX,bpr,vpr,yvgO,wapA和nprE中筛选出最适合碱性果胶酶胞外表达的信号肽bpr,胞外酶活达到313.7 UmL-1.在此基础上使用强启动子P43表达碱性果胶酶,将碱性果胶酶产量提高到446.3 UmL-1.最后,通过3L罐发酵,碱性果胶酶胞外产量达到632.6 UmL-1,首次实现碱性果胶酶在枯草表达系统中的高效表达.

摘要： 采用实验室自行筛选的Bacillus subtilis 7-3-3在小型发酵罐上研究了补料发酵、高浓度底物液化处理和两段pH控制对碱性果胶酶产量的影响.通过补料发酵延长菌体分裂生长时间,提高了生物量.通过对补料培养基中的碳源进行液化处理,大大降低了料液的粘滞系数,提高了发酵罐传质传热效率.跟据不同发酵阶段对理化环境要求的差异,对发酵过程进行了两段pH控制,采用上述方法使碱性果胶酶的单位酶活力达到了743.5 U/ml,平均容积生产效率达到19.6 U/(mL·h).为进一步提高菌株的产酶能力,采用穿梭载体将自身来源的pelA基因的表达盒导入B.subtilis 7-3-3,提高pelA在菌体中的基因拷贝数,实现了碱性果胶酶的本源过表达,使最高碱性果胶酶单位酶活力达到了1628.6 U/ml,为原始菌株产酶能力的4.5倍.

摘要： 采用离心、超滤、硫酸铵沉淀、离子交换层析等方法,对枯草芽孢杆菌工程菌发酵液中的碱性果胶酶进行了分离纯化,并确定了离子交换层系的最佳条件.结果表明,用截留分子量10000 Dalton超滤膜对粗酶液样品进行超滤,回收率达到73.3％,比活力为259.7U/mg;进一步采用分级盐析法,回收率达到62.9％,比活力为1084U/mg,最佳离子交换条件为:0～1.0 mol/LNacl(缓冲体系为Gly-NaOH pH8.6)溶液线性洗脱,DEAE-Sephorose CL-4B阴离子交换层析分离,在该条件下酶的比活力提高到1230U/mg,最后经Sephadex-G75柱层析,比活力提高到2352 U/mg,纯度为粗酶液12.5倍,回收率21.6％,最后获得的碱性果胶酶经考马斯亮蓝染色,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,显示其分子量为43 kDa,碱性果胶酶纯度达到电泳纯.

摘要： 本研究基于对PEL 168的结构分析，分别从增加盐桥，增加二硫键、增加局部结构的柔韧性等方面进行理性设计提高PEL168的比酶活和稳定性，但是大部分设计都造成了酶活的降低或者完全失活，只得到了一个比酶活提高1.32倍，pH稳定性提高的突变体V 132E。因此采用随机突变进行改造，利用error-prone PCR建立突变体文库，通过果胶底物平板初筛和%孔板复筛得到一个比酶活提高1.81倍的突变体K47E(640U/mg)，在50°C时的半衰期也延长至4.5h。鉴于有利突变的累积效应，将突变位点V 132E和K47E进行组合，得到双突变体K47E/V 132E，其比酶活提高至873U/mg。

摘要： 在众多的纺织纤维中,麻类纤维是极具发展潜力的绿色环保纤维.然而,作为麻类纤维原料的原麻中含有大量的胶质,如果胶、半纤维素、木质素和蜡脂质等,不能直接用于纺纱工艺,必须经脱胶处理才能进行后续加工.麻脱胶是一个复杂的提取麻纤维的过程.从环境保护角度考虑,生物脱胶被认为是能够取代耗能大、效率低、污染严重的传统脱胶工艺的极有发展前途的一种方法.用基因工程菌产生的碱性果胶酶处理代替碱对麻织物进行煮练加工和整理工艺,以去除初生胞壁中的果胶物质,在比较缓和的pH值和温度条件下使织物手感柔软,强度高,而且还能避免因微生物处理造成的纤维素的降解.

摘要： 印染行业节能减排需要从多个方面着手进行，比如在新工艺、新技术方面，近年生物酶在印染中的成功应用取得了非常好的节能减排效果，从早期的退浆酶应用于淀粉浆退浆工艺，除氧酶处理等工艺，都大大降低了印染前处理中的废水产生及能耗；为适应更加严格的印染节能减排要求，文中介绍了康地恩生物集团将最新研制的碱性果胶酶、独特高浓中性纤维素酶等产品应用于印染的短流程前处理工艺，在之前染整节能的基础上,更加具有新的节能效果。

摘要： 本发明公开了一种比酶活及热稳定性提高的低温碱性果胶裂解酶突变体。该突变体具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；或在SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列基础上缺失、替换、插入或/和添加一个至几个氨基酸的保守性突变而获得的具有低温碱性果胶裂解酶活性的氨基酸序列。本发明提供的突变体的比酶活及热稳定性均有较大幅度的提高，更加适合纺织脱胶、洗涤等领域工业化生产的需要，满足社会生产的需求。

摘要： 发酵法制备碱性果胶酶过程中提高碱性果胶酶酶活的方法，属于生物酶制备技术领域。本发明通过控制氧气在发酵液中的传递速度体积溶氧系数(K

摘要： 一种产碱性果胶酶菌株及其发酵生产碱性果胶酶的方法，属于生物工程技术领域。本发明提供了一株产碱性果胶酶的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)BP-CO-01突变株，并提供了用该菌株在液体流加培养基中发酵制备碱性果胶酶的方法。本发明菌种为从山东烟台某葡萄处理工厂土壤中分离后诱变得到，本发明以菜粕为碳源的诱导物，豆粕为氮源，添加适当葡萄糖、磷酸氢二钾、碳酸钠和水分，在发酵后期流加柠檬酸钠以控制发酵液中蛋白酶的含量，减少蛋白酶对短小芽孢杆菌表达的其他酶的分解，从而达到产碱性果胶酶。发酵液过滤后，滤液即碱性果胶酶溶液，超滤浓缩得到浓缩酶液或通过其他后加工方式得到不同的碱性果胶酶制剂，如微丸，颗粒或粉剂。

摘要： 一种碱性果胶酶高产菌及其筛选方法和用该菌株发酵法生产碱性果胶酶，属于生物工程技术领域。本发明菌种为一株短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)CCTCC NO：M203042，是从腐烂桔子表皮上经平板透明圈筛选而得。经液体深层发酵可得碱性果胶酶酶活20u/ml。该碱性果胶酶可用于棉纺织物精练处理。

摘要： 一株产碱性果胶酶工程菌及其构建和用该菌生产碱性果胶酶的方法，属于生物工程技术领域。本发明以非致病的芽孢杆菌(Bacillus sp)WSHB04-02基因组DNA为模板，采用PCR扩增技术，获得包含1.2kb的编码碱性果胶酶基因片段的序列pel。同时从工业化生产的需要考虑，利用穿梭表达载体构建重组酵母菌Pichiapastoris(pel)即为产碱性果胶酶(E.C.4.2.2.2)工程菌CGMCC No.2143。还提供了CGMCC No.2143为发酵菌株生产碱性果胶酶的方法。该基因工程菌目标蛋白胞外分泌且胞外蛋白种类少，简化了微生物生产碱性果胶酶的提纯工艺，降低了生产成本，缩短了发酵时间，提高了生产效率，为产碱性果胶酶微生物发酵法工业化奠定了基础。

摘要： 发酵法制备碱性果胶酶过程中提高碱性果胶酶酶活的方法，属于生物酶制备技术领域。本发明通过控制氧气在发酵液中的传递速度体积溶氧系数(K

摘要： 一种碱性果胶酶高产菌株及其发酵生产碱性果胶酶的方法，属于生物工程技术领域。本发明提供了一株高产碱性果胶酶的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)BP－CO－01突变株，并提供了用该菌株在液体流加培养基中发酵制备碱性果胶酶的方法。本发明菌种为从山东烟台某葡萄处理工厂土壤中分离后诱变得到，本发明以菜粕为碳源的诱导物，豆粕为氮源，添加适当葡萄糖、磷酸氢二钾、碳酸钠和水分，在发酵后期流加柠檬酸钠以控制发酵液中蛋白酶的含量，减少蛋白酶对短小芽孢杆菌表达的其他酶的分解，从而达到果胶酶的高产。发酵液过滤后，滤液即碱性果胶酶溶液，超滤浓缩得到浓缩酶液或通过其他后加工方式得到不同的碱性果胶酶制剂，如微丸，颗粒和粉剂。

摘要： 一种碱性果胶酶高产菌及其筛选方法和用该菌株发酵法生产碱性果胶酶，属于生物工程技术领域。本发明菌种为一株短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)CCTCC NO：M203042，是从腐烂桔子表皮上经平板透明圈筛选而得。经液体深层发酵可得碱生果胶酶酶活20u/ml。该碱性果胶酶可用于棉纺织物精练处理。

摘要： 一株产碱性果胶酶工程菌及其构建和用该菌生产碱性果胶酶的方法，属于生物工程技术领域。本发明以非致病的芽孢杆菌(Bacillus sp)WSHB04－02基因组DNA为模板，采用PCR扩增技术，获得包含1.2kb的编码碱性果胶酶基因片段的序列pel。同时从工业化生产的需要考虑，利用穿梭表达载体构建重组酵母菌Pichiapastoris(pel)即为产碱性果胶酶(E.C.4.2.2.2)工程菌CGMCC No.2143。还提供了CGMCC No.2143为发酵菌株生产碱性果胶酶的方法。该基因工程菌目标蛋白胞外分泌且胞外蛋白种类少，简化了微生物生产碱性果胶酶的提纯工艺，降低了生产成本，缩短了发酵时间，提高了生产效率，为产碱性果胶酶微生物发酵法工业化奠定了基础。

摘要： 本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种定点突变获得的抗胰蛋白酶的碱性果胶酶BPAP‑11及其基因和应用。所述果胶酶BPAP‑11具有SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。经过改造获得的BPAP‑11在保持原有高活性的基础上，抗胰蛋白酶的能力大幅度提高，可以作为饲料或洗涤剂的添加剂与胰蛋白酶混合使用而保持较高活性，尤其是洗涤行业，拓宽了酶的应用领域。