甲基化特异性PCR

摘要： 目的 分析宫颈脱落细胞CADM1、C13ORF18、PCDHA4和TERT 4种基因的甲基化水平在识别宫颈癌及癌前病变中的价值.方法 收集2019年9月至2020年8月在上海交通大学医学院附属新华医院妇科就诊的101例女性患者及20例健康女性(对照组)的宫颈脱落细胞,提取基因组DNA进行人乳头瘤病毒(HPV)16/18检测及CADM1、C13ORF18、PCDHA4和TERT 4种基因的甲基化特异性PCR检测,分析4种基因甲基化单项或联合HPV16/18检测在宫颈癌或癌前病变中的诊断性能.结果 C13ORF18和TERT基因的甲基化阳性率在对照组、低级别鳞状上皮内病变(LSIL)组、高级别鳞状上皮内病变(HSIL)组和宫颈癌组4组间比较,差异有统计学意义(P0.05).C13ORF18和TERT基因甲基化单项检测用于宫颈癌的筛查具有良好的诊断性能,C13ORF18基因甲基化单项检测诊断宫颈癌的特异度为93.94％,TERT基因甲基化单项检测诊断宫颈癌的灵敏度为86.36％,联合HPV16/18检测并没有明显提高诊断性能.结论 宫颈脱落细胞CADM1、C13ORF18、PC-DHA4和TERT这4种基因中,TERT和C13ORF18基因甲基化单项检测在宫颈癌及癌前病变的筛查中体现了较好的临床价值.

摘要： 目的 探讨谷胱甘肽过氧化物酶3(glutathione peroxidase 3,GPX3)基因启动子区在胰腺癌中的甲基化情况及其表达调控机制。方法 应用半定量RT-PCR、甲基化特异性PCR(methylation specific PCR,MPCR)和硫化测序(bisulfite sequencing,BSSQ)技术对6株人胰腺癌细胞系(PANC-1、PANC3.11、MIAPaCa-2、SW1990、AsPC-1和CFPAC-1)和153例胰腺癌组织进行分析。结果GPX3在PANC-1、PANC3.11和SW1990细胞中高表达,其启动子区呈现非甲基化状态;在CFPAC-1细胞中低表达,其启动子区呈现部分甲基化状态;在MIAPaCa-2和AsPC-1细胞中缺失表达,其启动子区呈现完全甲基化。应用去甲基化试剂5-aza处理后,PANC-1、PANC3.11和SW1990细胞中表达无变化,CFPAC-1细胞中表达增加,MIAPaCa-2和AsPC-1细胞中恢复表达。结果表明GPX3的表达受启动子区甲基化调控。BSSQ结果进一步验证了其在细胞系中的状态和MSP的扩增效率。GPX3在胰腺癌中的甲基化率为26.1%(40/153),GPX3甲基化与年龄、吸烟和肿瘤分化程度有相关性(P0.05),GPX3甲基化是胰腺癌诊断的潜在标志物。结论 GPX3在胰腺癌中频繁发生甲基化,其表达受启动子区甲基化调控。

摘要： 目的探讨E3泛素连接酶家族的环指蛋白180(ring finger protein 180,RNF180)基因在胰腺癌中的甲基化情况及其表达调控机制。方法9个胰腺癌细胞系和112例原发性胰腺癌组织,以及半定量RT-PCR和甲基化特异性PCR(methylation specific PCR,MSP)技术被应用于RNF180基因的甲基化状态和表达调控研究。结果RNF180在CFPAC1、Panc5.04和PANC1细胞中高表达,MSP结果显示其启动子区域呈非甲基化状态;在T3M4和MIAPaCa2细胞中表达减少,其启动子区呈部分甲基化状态;在SW1990、Panc10.05、PANC3.11和AsPC1细胞中RNF180表达缺失,其启动子区呈完全甲基化状态。应用去甲基化药物5-aza-dc处理后,CFPAC1、Panc5.04和PANC1细胞中表达无变化,T3M4和MIAPaCa2细胞中表达增加,SW1990、Panc10.05、PANC3.11和AsPC1细胞中恢复表达。结果表明RNF180的表达受启动子区甲基化调控。RNF180基因在原发性胰腺癌中的甲基化率是31.25%(35/112)。RNF180甲基化与肿瘤分期有相关性(P0.05)。结论RNF180在胰腺癌中频繁发生甲基化,其表达受启动子区甲基化调节。RNF180甲基化是胰腺癌潜在的诊断和预后标志物。

摘要： 目的 研究TMEM176A基因在人胃癌中的甲基化情况及其临床意义.方法 应用甲基化特异性PCR技术对209例胃癌组织进行分析.用癌症基因组图谱(TCGA)数据库进一步分析TMEM176A的表达受甲基化调控.结果 TCGA数据库分析发现,TMEM176A的表达与K450甲基化芯片结果显示的启动子区的18个CpG位点甲基化呈负相关(R=-0.622,P<0.0001).甲基化特异性PCR检测发现,TMEM176A在胃癌中的甲基化率为68.42％(143/209),TMEM176A甲基化与淋巴结转移相关(P<0.05).结论 TMEM176A在胃癌中频繁发生甲基化,TMEM176A基因的表达受启动子区甲基化的调控,TMEM176A基因是潜在的胃癌诊断和预后标志物.

摘要： 目的 探讨地西他滨对人乳腺癌细胞中miR-5047 表达及其启动子甲基化状态的影响.方法 用甲基化特异性PCR(MSP)法和qRT-PCR 法分别检测人乳腺正常MCF-10A 细胞和人乳腺癌MDA-MB-231、MCF-7 细胞中miR-5047 的表达水平及miR-5047 启动子区的甲基化状态.用5 μmol/L 和10 μmol/L浓度的地西他滨分别处理MDA-MB-231 细胞,MSP 法检测miR-5047 启动子区的甲基化状态,qRT-PCR 法检测miR-5047 的表达.结果 与人乳腺正常上皮细胞MCF-10A 相比,乳腺癌MDA-MB-231 和MCF-7 细胞中miR-5047 呈低表达,而其启动子区均呈高甲基化状态;地西他滨处理后,MDA-MB-231 细胞中miR-5047 启动子区的甲基化水平明显降低,miR-5047 表达水平则显著升高.结论 地西他滨可通过降低乳腺癌细胞中miR-5047基因启动子区甲基化水平从而促进miR-5047 的表达.

摘要： 目的 探讨连接粘附分子3(junctional adhesion molecules 3,JAM3)基因启动子区在胰腺癌中的甲基化情况及其表达调控机制.方法 应用半定量RT-PCR和甲基化特异性PCR技术对8株胰腺癌细胞系(Panc3.11、Panc1、SW1990、Miapaca2、Aspc1、Panc 5.04、Panc10.05、CFpac1)和79例胰腺癌组织进行分析.结果 JAM3基因在Panc1、Miapaca2、Panc5.04、CFpac1细胞系中高表达,这些细胞启动子区为非甲基化状态.JAM3基因在Panc3.11、SW1990、Aspc1、Panc10.05细胞系中表达缺失,其启动子区为完全甲基化状态.去甲基化药物5-aza-dc处理后,缺失表达的细胞系恢复了JAM3的表达.这些结果表明JAM3基因在胰腺癌细胞中的表达受启动子区甲基化调控.JAM3基因在胰腺癌组织中甲基化率为48.1％(38/79),且JAM3甲基化与肿瘤分化相关(P<0.05),JAM3甲基化是胰腺癌诊断的潜在标志物.结论 JAM3基因在胰腺癌组织中频繁发生甲基化,且其表达受启动子区甲基化调控.

摘要： 目的 探讨趋化因子配体CXCL14(C-X-C motif chemokine ligand 14)基因启动子区在食管癌中的甲基化情况及其表达调控机制.方法 应用半定量RT-PCR和甲基化特异性PCR技术对7株食管癌细胞系(KYSE30、KYSE140、KYSE150、KYSE180、KYSE410、KYSE450、KYSE510)和85例食管癌组织进行分析.结果 CXCL14在食管癌细胞中的表达受基因启动子区甲基化调控,CXCL14在KYSE140、KYSE180、KYSE450、KYSE510中表达减少,启动子区呈现部分甲基化状态;在KYSE30、KYSE150和KYSE410中表达缺失,启动子区呈现完全甲基化状态.去甲基化药物5-aza-dc处理后,表达减少的细胞其表达增加,缺失表达的细胞系恢复其表达.CXCL14基因在原发食管癌中的甲基化率为71.8％(61/85),甲基化与肿瘤大小相关(P<0.05).结论 CXCL14基因甲基化是食管癌诊断的潜在标志物.

摘要： 目的 通过对2例不同类型的Prader-Willi综合征的诊断,分析不同的分子遗传实验技术在这类罕见遗传病诊断中应用的优点和局限性.方法 首先应用染色体微阵列分析(chromosomal microarray analysis,CMA)对2例全面发育迟滞的婴幼儿血液样本进行初步检测,之后对病例1行CMA家系分析,用ChAS和UPD-tool软件计算检测数据.对病例2加做甲基化特异性PCR检测.结果 病例1经CMA和UPD-tool家系分析诊断为母源单亲二体型Prader-Willi综合征,并发现该病例的15号染色体实际为同源/异源一体的整条母源单亲二体型.病例2经CMA结合甲基化特异性PCR检测诊断为缺失型Prader-willi综合征.结论 针对不同分子遗传检测技术的优点和局限性合理选择正确的实验方法,能够有效地帮助临床和准确诊断基因组印记病,以便及早干预、治疗,获得更好的疗效和预后.

摘要： 目的:分析非小细胞肺癌(NSCLC)中黑素瘤相关抗原D4(MAGE-D4)基因启动子甲基化程度与MAGE-D4 mRNA表达水平及患者临床病理特征的关系.方法:采用甲基化特异性PCR(MSP)法检测38例NSCLC患者癌组织及其癌旁组织中MAGE-D4启动子甲基化程度,实时荧光定量PCR(qPCR)法检测组织中MAGE-D4 mRNA相对表达量,分析MAGE-D4启动子甲基化频率与患者临床病理特征的关系.结果:肺癌组织中MAGE-D4基因甲基化频率为23.68％,明显低于癌旁组织的86.84％(P3 cm的肺癌患者MAGE-D4甲基化发生率明显低于肿瘤直径≤3 cm患者(P<0.05).结论:NSCLC中MAGE-D4基因转录活性的增强与其启动子低甲基化相关;肿瘤直径较大的NSCLC患者MAGE-D4甲基化发生率较低.

摘要： 目的：检测骨髓增生异常综合征(MDS)患者血浆中FHIT基因启动子区域甲基化状态及地西他滨对其甲基化的影响.方法：采用甲基化特异性PCR(MSP)法检测1例初治的MDS患者、3例MDS转AML患者地西他滨序贯半量CAG方案化疗治疗前后血浆中FHIT基因启动子区域CPG岛甲基化情况,并分析临床疗效.

摘要： 目的：检测骨髓增生异常综合征(MDS)患者血浆中FHIT基因启动子区域甲基化状态及地西他滨对其甲基化的影响.方法：采用甲基化特异性PCR(MSP)法检测1例初治的MDS患者、3例MDS转AML患者地西他滨序贯半量CAG方案化疗治疗前后血浆中FHIT基因启动子区域CPG岛甲基化情况,并分析临床疗效.

摘要： 目的：检测骨髓增生异常综合征(MDS)患者血浆中FHIT基因启动子区域甲基化状态及地西他滨对其甲基化的影响.方法：采用甲基化特异性PCR(MSP)法检测1例初治的MDS患者、3例MDS转AML患者地西他滨序贯半量CAG方案化疗治疗前后血浆中FHIT基因启动子区域CPG岛甲基化情况,并分析临床疗效.

摘要： 目的：检测骨髓增生异常综合征(MDS)患者血浆中FHIT基因启动子区域甲基化状态及地西他滨对其甲基化的影响.方法：采用甲基化特异性PCR(MSP)法检测1例初治的MDS患者、3例MDS转AML患者地西他滨序贯半量CAG方案化疗治疗前后血浆中FHIT基因启动子区域CPG岛甲基化情况,并分析临床疗效.

摘要： 本发明的cMethDNA方法是QM‑MSP方法(美国专利号8,062,849)的新颖的改进，特别地旨在以已经报道的最低拷贝数定量检测流体诸如血清或血浆中的肿瘤DNA(或其他循环DNA)。与任何其他基于PCR的测定相比特有的是，将少量拷贝的合成的多核苷酸标准品(STD基因)添加至等分的患者血清。在标准过程中，将用于多个感兴趣的基因(TARGET基因)的标准品的混合物添加至血清样品。纯化并处理总DNA后，进行PCR(多重步骤)，其中用相同的外部引物组共扩增STD基因和TARGET基因。在第二巢式PCR步骤中，存在于第一PCR反应的稀释物中的扩增子经受实时PCR，并通过双色实时PCR对一个孔中的各基因进行定量。产物通过用对甲基化的TARGET基因和相关的STD基因特异性的内部引物组的绝对定量来计算。公开了制备STD基因标准品的方法及cMethDNA方法的用途以及包含其的试剂盒。

摘要： 本发明公开了一种多重巢式甲基化特异性PCR检测试剂盒，由以下物质组成：①核苷酸序列如SEQ ID NO.1～42所示的引物；②PCR工作液。所述多重巢式甲基化特异性PCR检测试剂盒的使用方法，步骤如下：（1）取患者血清提取DNA；（2）取DNA溶液，进行甲基化修饰；（3）使用试剂盒进行PCR检测；（4）结果判断：取所得产物，琼脂糖凝胶电泳，凝胶放置凝胶成像系统进行拍照分析，肉眼判断反应结果。本发明的多重巢式甲基化特异性PCR（MN-MSP）检测技术，最大限度地克服了血清游离DNA微量及单一甲基化标记物敏感性、特异性不高的缺点，实现了对7个目的基因甲基化状态的高效检测，具有特异性强、准确性高等优点，可作为一种有效的早期上皮性卵巢癌诊断检测手段。

摘要： 本发明公开了一种多重巢式甲基化特异性PCR扩增引物，包括核苷酸序列如SEQ IDNO.1～42所示的引物。所述多重巢式甲基化特异性PCR扩增引物的使用方法，步骤如下：（1）取患者血清提取DNA；（2）取DNA溶液，进行甲基化修饰；（3）采用引物配合PCR工作液进行检测；（4）结果判断：取所得产物，琼脂糖凝胶电泳，凝胶放置凝胶成像系统进行拍照分析，肉眼判断反应结果。本发明的多重巢式甲基化特异性PCR（MN-MSP）检测技术，最大限度地克服了血清游离DNA微量及单一甲基化标记物敏感性、特异性不高的缺点，实现了对7个目的基因甲基化状态的高效检测，具有特异性强、准确性高等优点，可作为一种有效的早期卵巢癌诊断检测手段。

摘要： 本发明提供了方法、组合物和试剂盒，该方法、组合物和试剂盒用于鉴定靶核酸分子的甲基化状态、靶核酸分子中核苷酸基因座的甲基化状态，或者用于鉴定靶核酸分子中一个或多个甲基化或未甲基化核苷酸的基因座。甲基化状态通过以下方式进行：用可修饰靶核酸分子中一个或多个核苷酸作为靶核酸分子甲基化状态的函数的试剂处理甲基化的靶核酸分子，甲基化特异性扩增靶核酸分子、断裂扩增产物并且检测一个或多个片段，从而鉴定靶核酸分子的甲基化状态、靶核酸分子中核苷酸基因座的甲基化状态、或者靶核酸分子中一个或多个甲基化或未甲基化的核苷酸的基因座。

摘要： 本发明公开了一种多重甲基化特异性PCR引物设计方法及系统，本发明实施步骤包括根据用户需求设置参数，对目标甲基化位点进行引物设计及筛选，然后对筛选出的多个甲基化位点引物对两两进行配对并检查兼容性，选择数量最大的可兼容的多重引物组合，最后对设计完成的多重引物组合进行评价，并决定是否需要重新设计引物。本发明能实现超长长度序列的多重甲基化特异性PCR引物设计，能有效减少单对引物内部之间和多对引物之间dimer/hairpin等二级结构的出现以及在基因组中的非特异性扩增，设计出的引物特异性强，提高了多重甲基化特异性PCR实验测试过程的可操作性和准确度，同时大大提高了工作效率。

摘要： 本发明涉及一种DNA甲基化PCR检测引物或探针的特异性检测方法。该方法包括：S1、将DNA甲基化PCR检测引物或探针所检测的目标DNA序列分别进行四种转换，获得转换后的序列；S2、以包括步骤S1中转换前后序列在内的序列分别作为模板，用每对DNA甲基化PCR检测引物或每条DNA甲基化检测探针对所述模板进行特异性搜索和比对分析；S3、根据搜索和比对分析的结果评价或筛选引物或探针。本发明能够有效解决DNA甲基化PCR检测引物或探针的特异性检测过程中甲基化序列的影响，保证特异性检测的错配碱基来自真正的错配。同时通过一系列评价，实现DNA甲基化PCR检测引物或探针特异性的检测。

摘要： 本发明的cMethDNA方法是QM-MSP方法(美国专利号8,062,849)的新颖的改进，特别地旨在以已经报道的最低拷贝数定量检测流体诸如血清或血浆中的肿瘤DNA(或其他循环DNA)。与任何其他基于PCR的测定相比特有的是，将少量拷贝的合成的多核苷酸标准品(STD基因)添加至等分的患者血清。在标准过程中，将用于多个感兴趣的基因(TARGET基因)的标准品的混合物添加至血清样品。纯化并处理总DNA后，进行PCR(多重步骤)，其中用相同的外部引物组共扩增STD基因和TARGET基因。在第二巢式PCR步骤中，存在于第一PCR反应的稀释物中的扩增子经受实时PCR，并通过双色实时PCR对一个孔中的各基因进行定量。产物通过用对甲基化的TARGET基因和相关的STD基因特异性的内部引物组的绝对定量来计算。公开了制备STD基因标准品的方法及cMethDNA方法的用途以及包含其的试剂盒。

摘要： 本发明涉及粪便中检测结肠肿瘤发病相关抑癌基因表观突变试剂盒及其用途。试剂盒包括：(1)结肠肿瘤发病相关的抑癌基因启动子区CpG岛定量甲基化扩增引物3对及探针3条；(2)PCR扩增用试剂。通过本试剂盒得到的PCR扩增产物，可以通过定量甲基化特异性PCR(quantitative methylation specific PCR,qMSP)方法分析基因CpG岛甲基化状态。本试剂盒具有高效的CpG岛甲基化检出作用。用于粪便中结肠肿瘤发病相关抑癌基因表观突变检测。

摘要： 本发明公开了一种多重巢式甲基化特异性PCR扩增引物，包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1～42所示的引物。所述多重巢式甲基化特异性PCR扩增引物的使用方法，步骤如下：（1）取患者血清提取DNA；（2）取DNA溶液，进行甲基化修饰；（3）采用引物配合PCR工作液进行检测；（4）结果判断：取所得产物，琼脂糖凝胶电泳，凝胶放置凝胶成像系统进行拍照分析，肉眼判断反应结果。本发明的多重巢式甲基化特异性PCR（MN-MSP）检测技术，最大限度地克服了血清游离DNA微量及单一甲基化标记物敏感性、特异性不高的缺点，实现了对7个目的基因甲基化状态的高效检测，具有特异性强、准确性高等优点，可作为一种有效的早期卵巢癌诊断检测手段。

摘要： 本发明公开了一种多重巢式甲基化特异性PCR检测试剂盒，由以下物质组成：①核苷酸序列如SEQ ID NO.1～42所示的引物；②PCR工作液。所述多重巢式甲基化特异性PCR检测试剂盒的使用方法，步骤如下：（1）取患者血清提取DNA；（2）取DNA溶液，进行甲基化修饰；（3）使用试剂盒进行PCR检测；（4）结果判断：取所得产物，琼脂糖凝胶电泳，凝胶放置凝胶成像系统进行拍照分析，肉眼判断反应结果。本发明的多重巢式甲基化特异性PCR（MN-MSP）检测技术，最大限度地克服了血清游离DNA微量及单一甲基化标记物敏感性、特异性不高的缺点，实现了对7个目的基因甲基化状态的高效检测，具有特异性强、准确性高等优点，可作为一种有效的早期上皮性卵巢癌诊断检测手段。