牛流行热病毒

摘要： 1发病情况2016年以来,双江全县范围内牛流行热病发生,呈地方性流行。据不完全统计,全县黄牛发病1231头,因此病和继发其他疾病病死51头。2病原牛流行热病毒又名牛暂时热病毒,属弹状病毒科,暂时热病毒属。病毒对酸、碱、热敏感,温度60°C、pH值9.0,数十分钟内可灭活,对乙醚、氯仿等敏感。但在温度低于-20°C环境下低温保存,可长期保持毒力。

摘要： 鉴于牛流行热(Bovine Ephemeral Fever,BEF)对养牛行业的危害以及荧光定量PCR技术高效、快速、精准的优点,本研究针对牛流行热病毒(Bovine Ephemeral Fever Virus,BEFV)G基因建立荧光定量PCR检测方法.并用所建立的荧光定量PCR检测方法对临床采集的样本进行检测.结果显示:在GenBank数据库中对BEFV全基因组序列进行比对分析,找出保守序列,设计1对扩增BEFV G基因片段的引物,通过分子克隆构建重组质粒制备标准曲线,扩增效率是95.1％,用所建立的方法检测临床样本,阳性15份,阳性率为75％.该试验成功建立了检测BEFV的荧光定量PCR检测方法,证明云南省的牛场中广泛存在BEFV,建立的荧光定量PCR检测方法对BEFV的临床诊断和流行病学调查等具有应用价值.

摘要： 牛流行热病毒(BFFV)是引发世界范围内牛流行热最主要病原之一,给奶牛业的发展造成严重危害.本研究通过RT-PCR对疑似牛流行热奶牛抗凝血样品进行检测,选取阳性样品颅内接种3日龄乳鼠,7日后乳鼠死亡,鼠脑组织通过PCR扩增出BFFV目的条带,乳鼠颅内重复接种3次,乳鼠发病死亡时间明显提前.选取阳性脑组织接种BHK-21细胞,盲传3代后出现明显细胞病变,特异性引物扩增获得目的条带,测序结果与牛流行热病毒序列一致,表明成功分离到一株牛流行热病毒.

摘要： 目的以狂犬病病毒(RABV)弱毒株SAD株为载体,构建表达牛流行热病毒(BEFV)G蛋白的重组病毒SAD-BG。方法利用反向遗传技术将BEFV的G蛋白基因ORF插入到SAD株基因组的伪基因区,获得感染性克隆,与辅助质粒共转染BHK-21细胞,获得重组病毒SAD-BG株。结果与结论通过RT-PCR、免疫荧光染色鉴定,表明BEFV G蛋白基因存在于重组病毒基因组,且能表达自身RABV G蛋白与外源BEFV G蛋白。通过BHK-21细胞和NA细胞鉴定重组病毒的生长特性,在NA细胞中重组病毒的滴度高于亲本SAD株,可达1.3×108FFU/ml。成功构建了表达BEFV G蛋白的重组病毒SAD-BG,为进一步研制预防狂犬病和牛流行热(BEF)的二联疫苗奠定了基础。

摘要： 旨在解析我国牛流行热病毒(BEFV)分离株HN1/2012的基因组特征,为阐明我国BEFV毒株的演化规律提供数据.根据GenBank中收录的BEFV毒株的全基因组信息,设计引物,以RT-PCR扩增11段相互部分重叠的DNA片段,克隆至pGEM T-easy载体,分别进行测序,利用DNAStar软件进行序列拼接获得HN1/2012株的全基因组序列.根据BEFV编码基因的转录起始(TI)和转录终止/多聚腺苷酸化(TTP)序列分析获得各基因序列及其开放阅读框(ORF),与参考毒株比对序列相似性,并以G基因序列构建系统发生树,分析其遗传演化关系.结果显示:HN1/2012株基因组全长为14 899 nt,包含前导序列(50 nt)、N基因(1 328 nt)、P基因(858 nt)、M基因(691 nt)、G基因(1 896 nt)、GNs基因(1 785 nt)、α1α2基因(638 nt)、β基因(459 nt)、γ基因(400 nt)、L基因(6 470 nt)和尾随序列(70 nt).病毒9个基因分别由26、43、47、53、37、39、30、-21 nt的基因间隔区(IGR)连接.在全基因组水平,HN1/2012株与我国2002年浙江分离株JT02L的相似性最高,但G基因与同期分离株LYC11、LS11相似性最高.重组分析表明HN1/2012株未发生基因重组.HN1/2012株的演化可能与免疫选择压力导致的基因突变有关.本研究测定了HNI/2012株的基因组序列,为我国BEFV分离株的全基因组分子演化研究奠定了基础.

摘要： 为探索可用来开发牛流行热病毒(bovine ephemeral fever virus,BEFV)疫苗和诊断试剂的候选基因,本研究针对BEFV糖蛋白(G)基因设计了2对特异性引物,用PCR方法扩增基因片段,PCR产物经Xho Ⅰ和NdeⅠ双酶切后亚克隆到表达载体pET 30上,将鉴定正确的重组质粒(480-pET 30、1107 pET-30)转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,培养阳性菌株D600nm值为0.6～1.0,37°C下用1.0 mmol/L IPTG诱导表达目的蛋白,将其纯化之后进行SDS-PAGE和Western blotting免疫原性分析.同时,应用间接ELISA、动物免疫试验及交叉反应试验对目的蛋白进行分析.结果表明,首次发现的1 107 bp基因片段是分段表达的,具有很好的生物活性和特异性,更适合作为开发疫苗和诊断试剂的候选基因,为今后建立BEFV的血清学诊断方法及疫苗研发提供了理论基础.

摘要： 奶牛流行热又称三日热，是由牛流行热病毒引起牛的一种急性热性传染病。该病以突发高热，呼吸急促紧迫，并且伴有消化道机能障碍和行动障碍为主要特征。发生该病的牛多数经过2～3天呈良性经过．但也有造成继发感染死亡病例，部分奶牛场发病后呈全群爆发，发病率可达80％，死亡率6％左右，严重影响产奶量。

摘要： 根据NCBI上公布的牛流行热病毒G基因序列设计、合成了一对检测牛流行热病毒G基因的RT-PCR引物,以牛流行热疫苗为模板,建立了牛流行热的RT-PCR检测方法,经扩增得到大小799 bp的片段.该方法具有良好的特异性、敏感性,能扩增出含量为9.576 pg的BEFV RNA.从17份疑似牛流行热病毒感染的牛全血中检测出阳性病例5份,经测序后证明为牛流行热病毒G基因片段.结果表明,建立的一步法RT-PCR方法简便易行,可用于牛流行热的分离鉴定、临床病料的检测和分子流行病学调查.

摘要： One virus strain named as BEFV - SD was isolated from the infected cattle in Shandong Province , and it was systematically identified by a series of methods through cultivated in BHK - 21 cells. In result, the isolate could cause typical cytopathogenic effect in the BHK-21 cells after infection. The BEFV -SD could be neutralized by the positive sera with bovine ephemeral fever virus at the titer of 1 : 408. The isolate virus was sensitive to chloroform, diethyl ether and heat, and could be inactivated at 56°C for 10 minutes or 37 °C for 18 hours. The G gene was amplified by RT - PCR from the BHK -21 cells infected with BEFV - SD virus. The homology of G gene nucleic acid sequences among the virus in GenBank was more than 96. 3%.%利用BHK-21细胞,接种山东济南地区疑似牛流行热病牛高热期的抗凝血,经盲传3代,分离到1株病毒,经RT-PCR鉴定为牛流行热病毒,命名为BEFV-SD.理化特性试验表明:BEFV-SD对热敏感,56°C 10 min、37°C 18 h可被灭活,对乙醚、氯仿等敏感；BEFV-SD可被BEFV阳性血清中和,中和效价为1∶408；将BEFV-SD的G基因与GenBank中公布的BEFV进行同源性比较,同源性达到96.3％以上.

摘要： 一、前言牛流行热是由杆状病毒（Rhabdovirus）所引起之急性发热性疾病，在牛之间并不会经由直接接触、体液或空气传染，须透过库蠓等吸血性节肢动物做为媒介来传播疾病，目前仅有一种血清型。以乳牛、黄牛、水牛为主要宿主，但亦曾在鹿及羚羊体内发现有牛流行热的抗体存在，目前没有感染人的病例报告。牛流行热病毒属单股RNA病毒，结构包括封套与五个结构性蛋白（L、G、N、M1与M2），其中又以G蛋白最重要，因为此蛋白含病毒的专一性及中和性抗原部位，

摘要： 为建立一种快速、准确的牛流行热病毒的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法.本研究以NCBI中已公布的牛流行热G蛋白基因保守序列为靶基因设计合成特异性引物和TaqMan探针.利用设计的引物探针扩增检测牛流行热病毒G蛋白基因保守序列,收集到632bp的扩增产物,将扩增产物连接到表达载体pARN上制备重组质粒;将重组质粒穿刺菌划线培养于含Amp的LB培养基,挑选单菌进行扩大培养,提取得到含目的基因的质粒,转入BL21表达菌感受态细胞内,筛选扩增并诱导表达假病毒颗粒;以表达的假病毒作为荧光PCR的阳性标准品,用该标准品进行TaqMan实时荧光定量PCR扩增,通过扩增结果对牛流行热病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的特异性、灵敏度、稳定性进行评价;用该方法对临床样品进行检测,并将检测结果与传统PCR技术进行比较.本研究建立了牛流行热TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,并以检测结果制作标准曲线,得到标准曲线R2=0.9994,说明具有良好的线性关系;特异性实验结果显示,该方法扩增检测标准毒株结果中只有牛流行热病毒有特异的扩增曲线,其他毒株均为阴性,具有较好的特异性;敏感性检测结果表明,该方法的最低检测限度为2.53×10copies/μL;重复性试验结果表明,该方法循环阈值Ct的变异系数(CV)为0.53％～0.91％,具有良好的稳定性;67例临床样品的检测中,所建立的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的检出阳性率较传统PCR方法高10.44％.本研究建立了牛流行热病毒的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,该方法可用于临床上对牛流行热病毒的检测.

摘要： 为了解牛流行热病毒(BEFV)山东流行株G基因的特点，本研究从临床病料中获得山东流行株牛流行热病毒的G基因，并对其进行序列测定和分析。参考GenBank上牛流行热病毒的G基因序列，设计并合成1对特异性扩增G基因引物进行PCR，扩增目标片段，并克隆于pEASY-T3载体上，筛选阳性重组质粒进行测定序列，用MEGA软件、NJ法构建进化树。结果显示，该流行毒株G基因与GenBank中其它BEFV的G基因相比，核苷酸和氨基酸的同源性均大于96％;遗传进化关系分析结果表明，BEFV山东流行株与台湾流行株具有较高同源性和较近的亲缘关系。

摘要： 本发明涉及一种应用重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase Ploymerase Amplification，RPA)并结合侧流层析技术检测牛流行热病毒(Bovine Ephemeral Fever Virus，BEFV)所用的引物和探针组合及其试剂盒。本发明通过引物设计及筛选获得特异性的RPA引物和探针组合，利用RPA技术对BEFV进行检测，实现了较高的灵敏度、特异性和重复性；本发明只需对临床样本进行cDNA合成，且恒温扩增，不需要热循环反应，扩增阶段不需要特殊的仪器；结果可通过视觉直观检测，不需要检测仪，且反应速度快，敏感性高，可在非实验室环境下短时间内即可完成BEFV的临床现场检测。

摘要： 本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种牛流行热病毒蛋白复合物及其在制备牛流行热病毒自然感染抗体检测试剂盒中的应用。首先，本发明意外发现，牛流行热病毒GNS‑N端蛋白、GNS‑C端蛋白、α2蛋白、α3蛋白、β蛋白作为抗原能够特异性的区分牛流行热病毒自然感染和疫苗感染，用于牛流行热病毒自然感染抗体检测；其次，由牛流行热病毒GNS‑N端蛋白、GNS‑C端蛋白、α2蛋白、α3蛋白、β蛋白组成的复合物可捕获牛流行热病毒感染牛产生的抗体，而不与疫苗免疫牛产生的抗体反应，可用于牛流行热病毒感染牛的筛查，有效避免由于窗口期造成的利用单一抗原进行检测可能存在的漏检问题；且具有更高的灵敏度和准确度。

摘要： 本发明公开了用于检测牛流行热和牛流行热病毒的引物和探针及其应用，引物核苷酸序列如SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9所示，所述探针的核苷酸序列如SEQID NO：1所示。本发明利用ERA技术结合所述引物和探针建立了针对牛流行热病毒进行检测方法和检测试剂盒。扩增阶段搭配使用荧光恒温扩增仪，42°C恒温条件15分钟即可实现对目的片段的有效扩增，具有时间短、灵敏性高、特异性强和重复性好，成本低等优点，最低检测限为1.0×102copies/μL，可应用于基层实验室环境下短时间高精度的BEFV的临床检测，具有很好的应用前景。

摘要： 本发明涉及一种同时检测牛流行热病毒和牛呼吸道合胞体病毒的双重实时荧光定量PCR的引物和探针、检测试剂盒以及检测方法。该引物和探针基于牛流行热病毒序列自5’端第3413～3518位碱基和牛呼吸道合胞体病毒序列自5’端第1847～1988位碱基作为检测序列设计得到。利用本发明的检测操作简便、特异性强、灵敏度高，将在牛流行热病毒和牛呼吸道合胞体病毒的检测、毒株鉴定及疫苗生产中发挥作用。

摘要： 本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种重组牛流行热病毒糖蛋白乳酸乳球菌载体及其构建方法和应用，本发明首先将pgsA基因连接至NICE表达系统中构建得到pgsA重组质粒，然后将牛流行热病毒的G基因连接至上述的pgsA重组质粒中，最后转化至乳酸乳球菌感受态细胞中构建得到重组牛流行热病毒糖蛋白乳酸乳球菌载体。本发明构建的重组牛流行热病毒糖蛋白乳酸乳球菌载体利用pgsA锚定蛋白的特性，将牛流行热病毒糖蛋白融合表达，使牛流行热病毒糖蛋白表达在乳酸乳球菌的外表面，不仅可以用于制备牛流行热病毒的重组G蛋白，而且可以为跨膜表达体系的建立和新型口服基因工程疫苗的研制奠定基础。

摘要： 本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种双荧光素酶标记的牛流行热病毒蛋白复合物及其在牛流行热病毒感染抗体与疫苗抗体检测中的应用。本发明所述蛋白复合物包含萤火虫荧光素酶标记的牛流行热病毒P蛋白和海肾荧光素酶标记的GNS‑α2‑α3‑β融合蛋白。本发明所述的蛋白复合物可分别捕获牛流行热病毒感染牛或疫苗免疫牛产生结构蛋白抗体、病毒感染特异的GNS、α2、α3、β蛋白抗体，利用两种荧光素酶底物的差异，可在单孔实现两类抗体的检测，可用于牛流行热病毒感染和免疫的鉴别诊断。

摘要： 本发明属于医药技术领域，具体涉及瑞德西韦在制备抗牛流行热病毒药物中的应用。本发明首次发现化合物瑞德西韦能够有效抑制BEFV的增殖，且对细胞的毒性相对较小，经实验证明，瑞德西韦对BHK‑21细胞的半数细胞毒性浓度(CC50)是50μM，而对BEFV病毒的半数有效浓度(EC50)为25μM；瑞德西韦对BEFV的治疗指数为2，表明其具有开发成抗BEFV药物的前景，为瑞德西韦开辟了新的药物用途，也为开发高效特异的抗BEFV药物奠定实验基础并提供新的视野。

摘要： 本发明属于医药技术领域，具体涉及莫匹罗星在制备抗牛流行热病毒药物中的应用。本发明首次发现化合物莫匹罗星能够有效抑制BEFV的增殖，且对细胞的毒性相对较小，经实验证明，莫匹罗星对BHK‑21细胞的半数细胞毒性浓度(CC50)大于等于100μM，而对BEFV病毒的半数有效浓度(EC50)为12.5μM；莫匹罗星对BEFV的治疗指数为8，表明其具有开发成抗BEFV药物的前景，为莫匹罗星开辟了新的药物用途，也为开发高效特异的抗BEFV药物奠定实验基础并提供新的视野。

摘要： 本发明公开了一种牛流行热病毒反应原性的中和位点多肽，并将其定向耦联到非蛋白多聚体葡聚糖上，使用该耦联多肽可以实现牛流行热病毒中和抗体ELISA检测，显著提高了检测灵敏度，同时显著降低非特异背景读值，特异性高，操作简单，诊断速度快，在进行大规模检测中具有经济方便等优点，是一种便于普及的好方法，具有广泛的应用前景。另外，本发明所展示的检测方法，包被抗原用量可减至10ng/mL、或1ng/孔，显著降低了包被抗原成本，有利于市场技术推广使用。

摘要： 本实用新型公开了牛流行热病毒荧光PCR检测试剂盒，具体涉及试剂盒技术领域，包括试剂盒本体，所述试剂盒本体内部底端的一侧固定安装有第一连接块，所述第一连接块的一侧固定安装有固定装置，所述试剂盒本体内部的底端固定安装有隔板，所述隔板底端的一侧固定安装有第二连接块。本实用新型通过设置分类孔和隔板之间的相互配合，从而达到了存放多种试剂管的效果，避免了试剂盒在工作的时候，因为要考虑到避免试剂管混淆的问题，所以采用一个试剂盒只能存放一种试剂管，这样会导致试剂盒的浪费，而且试剂盒只能存放一种试剂管会导致试剂盒的功能过于单一，不利于试剂盒的销量，还会增加成本的问题，增强了装置的实用性。